显微技术与荧光读取在研究中的互补应用 隐球菌-阿米巴相互作用

本实验的总体目的是利用显微镜技术作为研究工具，观察环境中的捕食性阿米巴吞噬病原性真菌新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）的过程。本视频详细介绍了一种制备隐球菌细胞与阿米巴共培养体系的实验方案，我将采用共聚焦激光扫描显微镜和透射电子显微镜对其进行研究。通过这些技术所获得的信息，有助于揭示隐球菌细胞在感染过程中被内化后的生物学行为。

将测试的真菌菌株划线接种于YPD琼脂平板上。在30摄氏度下培养48小时。从培养48小时的平板上刮取一环菌体，接种至含有100毫升添加4%葡萄糖的YNB液体培养基的250毫升锥形瓶中。

将锥形瓶置于30摄氏度的摇床中孵育24小时。经过24小时的孵育后，使用血细胞计数板对真菌细胞进行计数，并用生理缓冲液将细胞浓度调整至每毫升一百万个细胞。在30摄氏度下，用蛋白胨酵母提取物葡萄糖培养基培养阿米巴细胞一周。

使用血细胞计数板对阿米巴细胞进行计数，并用新鲜的无菌ATCC 712培养基将细胞浓度调整至每毫升1000万个细胞。随后使用台盼蓝染色进行细胞活力检测。建议使用细胞活力至少为80%的细胞进行后续操作。

将200微升标准化的阿米巴细胞悬液加入贴壁载玻片的腔室中，在30摄氏度条件下孵育2小时，使细胞贴附于表面。在阿米巴细胞沉降期间，用异硫氰酸荧光素对标准化的隐球菌细胞进行染色。

将真菌细胞在室温避光条件下轻轻振荡两小时。洗涤后，取200 µL染色的隐球菌悬液加入已含有阿米巴细胞的适当腔室中。将制备好的共培养物在30 °C下继续孵育两小时。

共孵育结束后，用 PBS 洗涤小室两次，以去除所有未结合的阿米巴细胞，包括未被内化的隐球菌细胞。吸除用于固定细胞的戊二醛，并用 PBS 再洗涤小室两次。拆卸腔室载玻片。

使用共聚焦激光扫描显微镜观察共培养的细胞。为补充上述实验，用pHrodo染料对隐球菌细胞进行染色，该染料可特异性地检测被吞噬于食物泡内的细胞。将染色后的细胞加入黑色黏附型微孔板的孔中，该微孔板中已接种阿米巴细胞。

使用能够将对数信号转换为相对荧光单位的微孔板读板仪检测荧光。向已含有5 mL标准化阿米巴细胞的同一离心管中加入5 mL标准化的隐球菌细胞。将离心管在30°C条件下静置2小时。

离心后吸去上清液。用pH 7的1摩尔磷酸钠缓冲液配制的3%戊二醛固定沉淀物，固定时间为3小时，该沉淀物代表共培养的细胞。用磷酸钠缓冲液将共培养的细胞洗涤一次。

用同样缓冲的1%四氧化锇再次固定1.5小时，随后进行洗涤。将透射电镜样品（即共培养的细胞）置于梯度丙酮系列中脱水，依次为30%、50%、70%、95%和100%，每级15分钟。此处，最后的脱水步骤需更换两次丙酮重复进行。

通过称取正常稠度的环氧树脂来制备环氧树脂。将样品材料包埋于环氧树脂中。在70摄氏度下聚合透射电镜样品材料8小时。

使用安装在超薄切片机上的玻璃刀切割16纳米的切片。将切片在暗处用醋酸铀染色10分钟，随后再在暗处用柠檬酸铅染色10分钟。使用透射电子显微镜观察切片。

为便于说明，视频中检测了两个分离株，其中一个产生3-羟基脂肪酸，另一个则不产生。3-羟基脂肪酸是次要代谢产物，不参与隐球菌细胞的生长。以下是隐球菌与阿米巴之间相互作用瞬间的图像截图。

简而言之，可观察到隐球菌细胞在被内化前后的状态。在研究吞噬作用时，最好采用活体成像技术。然而，研究人员并不总能获得此类显微镜设备，以持续追踪吞噬过程。

一种可能的解决方案是通过读取相对荧光单位的定量数据来弥补这一局限性。柱状图即为我用来补充图像数据的一个示例。重要的是，无论是以图像形式呈现的定性数据，还是定量数据，均可在不同时间点进行采集。

通过整合所有信息，人们可以开始构建出吞噬作用过程中所发生事件的更完整图景。从定量数据可以明显看出，与不产生3-羟基脂肪酸的细胞相比，含有3-羟基脂肪酸的细胞对阿米巴作用的敏感性较低，因为被内化的细胞数量更少。透射电子显微镜（TEM）是一种特别强大的工具，因其具有高分辨率，能够对食物泡腔内提供鸟瞰式的观察视角，而这种细节在活体成像以及静态图像检查中常常被遗漏。

在这张特定的透射电子显微镜照片中，可以清楚地观察到隐球菌细胞表面的突起结构。此前有理论认为，这些细胞表面结构是将3-羟基脂肪酸释放到周围环境中的通道。具体而言，这些通道可能有助于将3-羟基脂肪酸输送至阿米巴食物泡的腔内，从而改变其内部环境，进而促进细胞存活。

pHrodo 或类似 FITC 的染料可能是更好的选择，因为它们仅在低 pH 条件下（如食物泡内）产生荧光。具体而言，pHrodo 仅能使研究者获取有关细胞内化情况的数据。为此，在染色前必须将细胞悬浮于磷酸盐缓冲液中，并确保阿米巴培养基处于中性 pH。

透射电子显微镜操作人员必须经过良好培训，以正确进行切片，因为这往往是结果容易因电子束轰击而导致扭曲和显微图像受损的关键环节。预计研究人员能够从本方案中获取足够信息，并在其自身研究中加以优化。此外，研究人员还可针对特定代谢物开发抗体，并将其应用于免疫荧光显微镜研究中，包括在透射电镜检查期间进行免疫金标记。