RNAi 筛选以鉴定秀丽隐杆线虫（C. elegans）的胚后表型

本实验的目的是利用基于RNAi的基因组筛选和荧光标记蛋白，在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中鉴定胚胎后调控蛋白表达与定位的因子。在构建合适的筛选菌株后，选择一个RNAi文库。实验的第一步是将文库中的克隆包装到细菌中。

随后对细菌进行筛选，扩增培养，并饲喂给同步发育的秀丽隐杆线虫。在允许线虫生长72小时后，观察其目标表型是否发生改变。最终，通过荧光显微镜观察被攻击蛋白的表达水平或亚细胞定位的变化。

该方法可用于鉴定对荧光标记蛋白正确亚细胞定位所必需的基因。然而，本实验方案可进行修改，以鉴定影响其他感兴趣的胚胎后表型的基因。与现有已发表的实验方案相比，该技术的主要优势在于，我们在铺板前先在细菌中诱导双链RNA的产生，从而优化了动物体内RNA干扰反应的一致性和水平。

演示该实验步骤的是来自我实验室的研究助理 Kathy Fuss。在开始实验后的两个月内，首先准备克隆文库，将所选饲喂文库克隆以及阳性和阴性对照分别划线接种于含有碳酸盐和四环素的 LB 平板上。阳性对照应使用含有可产生剂量依赖性胚胎后表型基因的克隆，例如 BLE four；阴性对照则使用空载体或含有预测为无表型表现的假基因的克隆。

将每个克隆接种到含有50微克/毫升碳酸酸的2毫升LB培养基中，37℃过夜培养。从划线平板上挑取单菌落接种，37℃振荡培养过夜，次日早晨进行后续操作。加入IPTG诱导双链RNA的产生，使菌液变浑浊，然后在相同条件下继续培养额外4至5小时。

加入IPTG可确保RNAI诱导的基因产物敲低效果比仅依赖NGM平板中的IPTG和螺杆更为一致和稳定。在IPTG诱导后，将每个克隆的30微升培养物点样到已准备好的24孔NGM RNAi平板的每个孔中，每个孔对应一个克隆。每块平板应设有两个孔用于对照。

仔细标记每个文库的位置。将24孔板中的克隆置于无菌超净台中，敞口干燥约20分钟。注意不要让琼脂边缘从培养板上脱离。

将同步化的线虫转移至培养皿后，接下来提供线虫制备的说明。在下一节中，从同步化的第一幼虫期（L1期）线虫开始。采用L1期幼虫可避免潜在的胚胎致死表型干扰。

拥有一批处于相同发育阶段的动物进行筛选，也能增强研究者对所观察到的变异是由 RNAi 引起的信心，而非仅仅源于不同发育阶段常见的正常变异。然而，如果 RNAi 导致发育延迟，筛选者应通过漂白法注意并记录这一现象。筛选品系应为混合发育阶段的群体。

只有卵壳完整的胚胎才能在此步骤中存活，若在20摄氏度下操作，可使动物发育至12小时内；若在16摄氏度下操作，则可使动物发育至18小时内，操作时间应在接种细菌培养物的当天进行。选取三个100毫米的培养皿，内含健康且同时具有重力感应、成虫和胚胎的筛选品系动物。

用无菌 M9 培养基清洗所有动物，并将洗涤液转移至带有螺帽的无菌 15 毫升离心管中。如果洗涤液体积大于 3.5 毫升，离心后保留 3.5 毫升液体，弃去多余部分；如果小于 3.5 毫升，则直接保留全部液体。

加入水或 M9 液体使体积增至 3.5 毫升，以使胚胎从成虫中游离出来；每管加入 1.5 毫升氢氧化钠与次氯酸钠混合液进行清洗。动物在此溶液中孵育时间不得超过 10 分钟。启动计时器后，对每根试管涡旋震荡 10 秒，之后每隔 2 分钟重复一次涡旋震荡。

每次涡旋振荡后，在解剖显微镜下观察溶液中的动物尸体。六到八分钟内，成虫将被破碎，胚胎应被释放出来。通过离心收集胚胎，并尽可能移除上清液，注意不要扰动沉淀。

然后，通过加入无菌M9培养基并振荡，将沉淀重悬于10毫升体积中。重复此洗涤步骤至少一次，直至无法检测到漂白剂气味为止。为了更精确地同步动物的发育阶段，可在不含食物的M9培养基中孵化胚胎，使动物停滞在L1阶段。

将胚胎转移至含有M9培养基的小锥形瓶中进行此操作。在适合该品系和实验的温度下，将锥形瓶振荡培养过夜。在此期间，线虫将全部孵化，并于次日停滞在L1期休眠阶段。

通过将幼虫转移至已准备好的表达双链RNA的细菌中，从设定的时间点恢复其生长。此操作与在24孔板上点加细菌的日期相同。首先将L1期动物转移至一个15毫升离心管中，并进行离心沉淀。然后将动物浓缩至0.5到1毫升M9缓冲液中，并取5微升浓缩的线虫接种到平板上。

统计平板上动物的数量，并调整浓缩的线虫溶液，每3至10微升加入30条线虫。最后，将约30微升处于同一发育阶段的动物点样到已制备好的每个孔中的细菌上。

每孔超过30只动物可能导致饥饿。待液滴干燥（需几分钟）后，用橡皮筋固定板盖，将培养板倒置于所需温度下孵育相应时间，以便在目标发育阶段对动物进行表型分析。当线虫准备就绪可进行筛选时，需确认阳性对照与阴性对照均表现出预期的表型。随后观察实验组动物是否存在发育异常。

接下来，使用解剖显微镜，将每个孔中的 8 到 12 个动物用 5 微升麻醉剂液滴转移到含 4% Agri PET 的载玻片上。盖上适当的盖玻片后，使用复式显微镜观察至少 5 个动物。系统记录基因名称、观察动物数量及表型结果的数据库。

对于每个RNAi实验，应尽可能通过另一种次要表型来验证任何由rRNAi产生的表型，并通过重复实验进行验证；重复实验可使用来自同一划线培养的细菌。较陈旧的划线培养可能导致液体过夜培养中细菌生长不良，因此应先重新划线培养。某些细菌培养物可能因质粒中表达的基因产物而生长不佳。

在此情况下，只需在涂板前浓缩细菌即可。对于持续进行的筛选，必须始终保持大量胚胎处于可随时分期的状态。筛选所用菌株应始终处于喂养状态，而非饥饿状态，并且须避免可能影响目标表型的污染。

我们制定了动物喂养的维护计划。通过RNAi技术，利用为此筛选设计的菌株，鉴定了影响DBL-1定位的基因。GFP标签标记的DBL-1正常表达包括腹神经索的细胞体，以及一排点状结构，这些动物被喂食针对DBL-1的反义RNA。

一种mRNA显示出DBL one的表达显著减弱。这些动物的体型也较小，与缺乏功能性DBL L one的动物相似。RNAi筛选成功鉴定出许多其他影响DBL one定位的基因，从而拓展了我们对TGFβ亚细胞运输机制的理解，并为后续更多研究提供了切入点。

采用此方法，一个人每周可合理地准备并观察两到四组实验。例如，周一和周二准备的动物可在周四和周五分别进行观察，而周五和周六准备的动物则可在下周一和周二进行观察。在整个筛选过程中，请遵循此操作步骤进行观察。

为确保有充足的胚胎用于分期，需定期维护筛选品系。同时，详细记录所有观察结果也非常重要。