无透镜视频显微技术用于贴壁细胞培养的动态定量分析

本方法的总体目标是获取并分析通过无透镜视频显微镜监测的大规模贴壁细胞群体的动态行为。因此，我们认为该技术在生物学多个领域具有应用价值，可用于研究细胞增殖、细胞囊性病变或药物筛选，以及各类生物过程的监测。该技术无需标记，操作十分简便。

但它在研究大规模细胞群体时非常有效。当我们从细菌检测领域转向哺乳动物细胞成像领域时，这一方法的理念得到了应用。此后，生物学家需要直接在培养箱内进行电路结构的时间序列成像。

然后，我们构建了一种可与培养箱兼容的定制无透镜视频显微镜，并开发了一种全息重建算法，以获取视场内大量细胞的图像。开始本实验前，先在室温下用纤连蛋白包被6孔玻璃底板1小时。1小时后，去除多余的纤连蛋白，并用PBS冲洗6孔玻璃底板。

本实验中使用的 Hela 细胞在 DMEM 加谷氨酰胺培养基中培养，培养基中添加 10% 经热灭活的胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素。每块培养板接种两万个细胞。使用玻璃底培养皿非常重要。

为了保证无透镜成像的质量，将培养板放置在无透镜视频显微镜上方的培养箱中。本延时成像所使用的无透镜视频显微镜为市售产品。

它采用金属氧化物半导体图像传感器，成像面积为29.4平方毫米，像素间距为1.67微米。多波长照明由位于细胞上方约5厘米处、一个150微米针孔上方的多芯片发光二极管装置提供。在开始延时成像采集之前，必须检查盖板上是否存在冷凝水。

因为冷凝会降低成像质量。如果培养皿盖上已出现冷凝，应清洁皿盖。使用市售的采集软件控制无镜头视频显微镜。

该系统同时执行延时图像采集和全息重建。在软件界面中输入所需的参数：将帧率设置为每10分钟采集1次，细胞培养类型设置为贴壁细胞，实验持续时间设置为3天。

启动延时成像采集。该图像显示了在29.4平方毫米区域内，单帧图像中蓝色通道原始采集的完整视野示例。图B为图A的局部放大，图C为图B的进一步放大。全息重建算法将自动处理无透镜采集数据，以获得细胞培养物的相位图像。

展示了相位解包裹前细胞的一个示例图像，随后是相位解包裹后的图像。细胞追踪通过 TrackMate 算法实现，该算法是 Fiji 的一个开源插件，用于单颗粒的自动追踪。在将完整的延时采集数据加载到 Fiji 中，并按照文本方案所述配置算法后，设置输入参数。

将估计的斑点直径设为15像素，检测器阈值设为0.25，连接最大距离设为15像素，间隙闭合最大距离设为15像素，轨迹中的斑点数量设为3.5。细胞追踪算法的第一步是在无透镜成像中检测细胞。结果显示了细胞追踪算法的结果，所有细胞轨迹均跨越五十帧，约8小时。

颜色编码对应于中位速度。底部面板是顶部面板中黄色矩形区域的详细图像。此处展示了一段细胞追踪的代表性视频片段。

细胞追踪过程结束后，点击分析按钮，以生成三个文本文件形式的结果。根据这些数据，按照文本方案及补充代码文件中详述的方法，使用专用算法进行细胞分割并检测细胞分裂事件。整合整个延时成像过程中所有单细胞的测量数据，可绘制出多个指标随时间变化的散点图。

整个视野中的细胞总数在2.7天内从两千增加到一万五千。乘以时间点的数量后，将产生一个包含大量被检测细胞的庞大数据集。每个细胞均以其坐标和形态学特征进行表征，例如干质量、面积、平均厚度、长轴长度和长宽比。

细胞示踪与细胞分割算法的结合，能够实现单细胞水平的动力学测量。本示例展示了持续约六十六小时的细胞轨迹分析，其中在以黄色圆圈标注的时间点处共观察到4次细胞分裂。随时间变化计算了多项指标：细胞表面积、干重、平均厚度以及细胞运动性。

在2.7天的观察期内，细胞周期持续时间的分布接近于对数正态分布，平均值为16.5小时。通过自动测量得到的细胞周期长度与手动测量结果具有良好的相关性。

还考察了其他参数，例如细胞初始干重、最终干重以及细胞周期中的平均生长速率。一旦掌握该方法，整个延时成像数据的分析可在数小时内完成，具体耗时取决于CPU配置和硬件性能。在进行该实验操作时，必须严格控制初始细胞浓度。

如果初始细胞浓度过高，细胞轨迹追踪算法将无法准确定义细胞的运动轨迹；但如果细胞浓度过低，则整个分析的统计学意义也会不足。通过遵循此操作流程，可开展类似自动化细胞追踪分析，以回答生物学、基础生物学或趋化性等领域的其他科学问题。

这一新技术还为细胞谱系的监测开辟了道路，有望为细胞周期的研究提供有趣的见解。观看本视频后，您应能充分理解如何利用无透镜视频显微技术进行延时成像，以及如何分析大量细胞群体。