利用停流分光光度法监测黄素依赖性单加氧酶的还原与氧化半反应

本实验采用停流装置检测 SID A 的不同光谱形式并测定反应速率。SID A 催化的反应可分为 FAD 的还原半反应和氧化半反应。氧化态的黄素与 NADPH 结合，反应生成还原态黄素和 NADP⁺；分子氧的反应及鸟氨酸的结合最终导致 C4 的生成。

鸟氨酸羟基化后生成羟基黄素，该羟基黄素脱水形成氧化态酶。NADP⁺在整个催化循环中保持结合状态，并且是最后释放的底物。停流装置可实现反应物小体积的快速混合并进行记录。

随着时间推移的光谱变化，物质损失型分光光度法可用来测量酶促反应中产物的生成速率，特别是瞬时中间产物的生成速率。本实验室的两位成员 Rita Robinson 和 Enviro Romero 将以黄素单加氧酶作为模型系统，演示这些实验。将 250 毫升 100 毫摩尔/升的磷酸钾缓冲液倒入含有搅拌子的 500 毫升布氏烧瓶中。

用橡胶塞密封烧瓶，然后将其置于搅拌台上，并将烧瓶的短管连接至Schlenk管线。在室温下对缓冲液进行抽真空脱气1小时，同时持续搅拌，随后用氩气吹扫。重复此过程五次。

最后用氩气冲洗烧瓶10秒。将烧瓶从真空歧管上拆下并放入手套箱中。保持烧瓶敞口，继续剧烈搅拌。

用每毫升18.13单位的葡萄糖氧化酶和100毫摩尔的葡萄糖溶液填充储液器注射器。现在将驱动阀设置为加载位置。填充驱动注射器。

接下来，将 F 阀门转至驱动位置。使用 Pro Data 控制软件，点击排空停止注射器，然后通过手动提升相应的驱动活塞，将缓冲液从 F 驱动注射器推入流路中。继续对其他三个驱动注射器进行操作，平衡一小时。

现在重新填充储液器注射器，并重复冲洗停流系统。为制备饱和氧气缓冲液，将溶液在搅拌条件下通入100%氧气鼓泡一小时。

然后从药瓶上取下短针头，等待10秒。接着取下长针头，并将密封的药瓶放入手套箱中。适用于N-A-D-P-H溶液。

将含有1毫克N-A-D-P-H的1.5毫升离心管放入手套箱中。加入300微升无氧的100毫摩尔/升磷酸钾缓冲液溶解，pH值为7.5。

取出 30 微升以测定 NADPH 浓度。接下来，为去除酶原液中的氧气，将溶液转移至含有搅拌子的 25 毫升小瓶中，盖上带有隔垫和瓶塞的盖子，并用铝帽密封。置于冰上。

连接至Schlenk管线，然后在真空条件下脱气20分钟，随后用氩气吹扫。最后，用氩气冲洗反应瓶10秒，并将其从真空多通管上移开。将反应瓶置于手套箱内的冰上。

在 pro data 控制软件的控制面板窗口中，选择光电二极管阵列、外部触发和对数刻度。同时启动 pro data 查看器软件，并定义数据文件的存储目录。

现在将储液器注射器 C 和 F 中的溶液更换为无氧的 100 毫摩尔磷酸钾缓冲液（pH 7.5）。将 C 和 F 的阀门转至驱动位置。在 Pro Data 控制软件中点击排空停止注射器。

然后通过手动升高相应的驱动活塞，将缓冲液从两个驱动注射器推入流动回路。再用储液注射器 C 和 F 重复冲洗三次。为确保彻底清除流动回路中的葡萄糖氧化酶，请继续在 pro 数据控制软件中点击基线。

用酶溶液替换储液器注射器 F 中的溶液。将 F 阀转至驱动位置。在 Pro Data 控制软件中点击排空停止注射器。

通过手动抬升相应的驱动活塞，将驱动注射器 F 中的酶溶液推入流路。返回 pro data 控制软件，将采集时间设置为 60 秒。确认两个驱动注射器均已装入对应的溶液，并且驱动活塞已与驱动注射器的活塞接触。

将两个阀门均转向驱动位置，并在Pro Data控制软件中点击“采集”以执行驱动。使用驱动获得的452纳米处的A值，重复三次测定酶的氧化态光谱数据。在混合前确定酶的浓度，并配制4毫升NADPH溶液。

用N-A-D-P-H溶液将填充储液器注射器C的浓度提高至1.5倍，并像之前所示那样将停止注射器排空并重新填充三次。现在，在酶被还原的过程中采集光谱，用无氧的100毫摩尔磷酸钾缓冲液（pH 7.5）冲洗流动回路中的内容物。接着，在Pro Data控制软件中点击基线。

然后将200 µL酶原液与1000 µL无氧、100 mmol/L磷酸钾缓冲液混合，pH 7.5。用该酶溶液替换储液器A中注射器内的溶液。

在 Pro Data 控制软件中将 A 阀转向驱动位置。单击停止注射器排空。通过手动提升相应的驱动活塞，将酶溶液从 A 驱动注射器推过流路系统。

将延迟时间设置为0.5秒，采集时间为60秒。确认所有驱动注射器均已装入相应的溶液，且驱动推杆与驱动注射器的活塞接触。然后将所有驱动阀门转至驱动位置，并在Pro Data控制软件中点击采集。

以三份平行样获取酶氧化形式的光谱数据。随后，将储液器注射器 B 中的溶液更换为 N-A-D-P-H 溶液，其浓度为注射器 A 中酶溶液浓度的 1.5 倍。将 B 阀门转至驱动位置，并如控制面板窗口中先前所示，将停止注射器排空并重新填充三次。

将延迟时间设置为 0.5 秒。在 20 秒时进行采集，将储液器注射泵中的海水溶液更换为充氧缓冲液。将 C 阀转至驱动位置。

在 pro data 控制软件中冲洗三次。将延迟时间设为 15 秒，采集时间设为 900 秒。在停流装置中，持续采集完全还原酶重新氧化过程中的光谱数据。

利用452 nm处的吸光度监测NADPH对SID A的厌氧还原过程，可通过检测黄素氧化还原状态的变化来实现。从氧化态SID A到完全还原态SID A的最终光谱，其光谱变化随时间被记录下来。通过将数据拟合至适当的方程，可确定该酶促反应步骤的速率。此外，在AF Sid A反应中，还可利用停流装置的双混合模式测定氧化速率及反应中间产物。C4a羟基黄素中间体在380 nm处具有明显的最大吸收峰（λmax），而氧化态酶的最大吸收峰位于450 nm。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在四到六小时内完成。请务必确保溶液处于厌氧状态。观看本视频后，您应能充分理解如何进一步开展后续实验（如快速化学分析），以研究 FLA 的相对性及其独立单体的溃疡性离子。

Quentin 有助于阐明这些中间产物的不稳定性质。