基于微流控平台的高通量蛋白质表达仪

本实验的总体目标是构建一种模块化蛋白质阵列，无需纯化步骤，因而可与任何蛋白质文库兼容。该目标首先通过组装PCR生成合成基因来实现，随后将合成基因点样到环氧基载玻片上。

使用PDMS与硅胶控制和流动模具制备微流控装置。然后将微流控装置与点样DNA微阵列对齐。最后将兔网织红细胞裂解液注入微流控装置，表达蛋白质。

最终可以获得通过荧光抗体标记显示的数千种蛋白质的表达结果。与现有的蛋白质微阵列等方法相比，基于微流控的技术具有多个优势。我们在芯片上微阵列DNA，然后利用细胞系统在装置上合成蛋白质。

因此，我们无需进行蛋白质纯化，且蛋白质始终不会干燥，整个实验过程中均保持新鲜状态。微流控技术还具有更高的灵敏度。为制备微流控装置，需将硅胶控制层和流道模具暴露于三甲基氯硅烷蒸气中10分钟，以促进弹性体脱模。

烘烤步骤完成后，分别按5:1和20:1的比例将硅基弹性体与固化剂混合，用于控制层和流体层模具。将5:1的PDMS倒入控制层中。对控制层进行脱气处理，并在80°C下烘烤30分钟。

接下来，将20:1的PDMS混合物以2,600 RPM转速在流体层上旋涂60秒，然后在80摄氏度下烘烤30分钟。缓慢将控制层从模具上分离，注意不要剥离SU-8图形。随后使用手术刀在显微镜下沿器件边缘切割，并用钝针打孔以接入控制通道。

从左上角开始，手动对准流体层和控制层，将控制层上的按钮阀置于反应室的中央。接着，对齐第一行，并逐行轻轻放下控制层。确保所有按钮阀均位于反应室的中央，且寻址阀和输入阀在正确位置与流体通道相交。

局部重复此过程，直至所有行均对齐。完全对齐后，从 PDMS 的侧面和角落小心地将其抬起，以释放其中的任何张力。然后在烘烤后于 80 摄氏度下烘烤该装置两小时。

沿外周切割并从流动模具的穿孔处剥离双层装置，以接触流道，从而为该装置生成DNA构建体。进行PCR以合成包含T7启动子、核糖体结合位点、开放阅读框（两端带有不同表位标签）以及T7终止子的合成基因。为准备将合成基因点样至阵列，配制聚乙二醇与D-甘油醛-3-磷酸二水合物的混合物，并将每反应2微升分装至384孔板的孔中。

孔板。将合成基因加入384孔板中，然后加入蒸馏水至终体积为20 µL。

接下来，使用微阵列点样器将一系列合成基因点样到环氧基修饰的玻璃基底上。在体视显微镜下，手动将微流控装置与基因阵列对齐，使DNA点位于DNA腔室的中央位置，然后依次对齐其余各行。

最后对整个装置进行微调，以消除PDMS上的任何应力，并确保其与微阵列良好粘合。局部抬起装置。最后，将装置置于80摄氏度的加热板上孵育过夜，使其与玻片牢固粘合。

本节使用食用染料以实现可视化。控制层中的阀门通过计算机使用 LabVIEW 进行驱动。LabVIEW 脚本通过电子控制箱控制一系列电磁微阀。

电磁阀歧管连接至压缩空气，用于控制进入装置上控制阀的气流和压力。使用内径为0.02英寸的柔性塑料管和不锈钢针，将装置连接到电磁阀歧管。用双蒸水充满管道，并将针插入控制层的通路孔中。

确保每个管子都连接到其对应的控制通道。为激活控制通道，运行 LabVIEW 应用程序，将气压设置为 5 PSI，然后通过 LabVIEW 脚本激活阀门施加气压。这会将水压入 PDMS 控制通道，以检测有缺陷器件的控制通道之间是否存在潜在的串扰。

首先填充三明治结构和地址阀门。毕竟，控制通道和阀门内部充满水，需对阀门进行预充液，以阻断其下方的流动通道。首先将空气压力增加至 15 PSI，然后通过连接至各个电磁阀的一组开关，在实验室视图程序中进行操作。

通过打开所有开关按钮来启动全部阀门，确保所有阀门均处于开启状态。将一根管子连接到其中一个流量输入口，并以4至5 PSI的压力向装置通入空气。这将使玻璃载片上粘连的阀门松脱。

该装置现已完成预处理，可进行可视化操作。本节使用黄色食用染料来观察试剂，无色溶液代表“嬉皮士”，以促进蛋白质阵列在表面的自组装，并防止微流控装置内的非特异性吸附。首先将一根新管子连接所需溶液后接入装置的任一流通通道，以化学方式修饰表面。然后将管子的另一端连接至手动多通阀，并打开气压驱动流。

在新离心管中加入40 µL生物素化的BSA，并将其中约一半样品以50 mmol/L HEPES缓冲液为流动相，流经装置20分钟。每步之间均使用50 mmol/L HEPES缓冲液冲洗，以去除未反应的底物。接下来，将25 µL链霉亲和素以50 mmol/L HEPES缓冲液为流动相，流经装置20分钟。

在生物素化的 BSA 上用 HEPES 缓冲液冲洗五分钟，以清洗按钮周围表面，关闭按钮阀门并流过剩余的生物素化 BSA，然后再次用 HEPES 缓冲液冲洗五分钟。最后，为了在按钮下方形成抗 His 标签阵列，打开按钮阀门并注入 30 微升 Penta-His 生物素溶液，反应 20 分钟，从而在装置上形成蛋白质阵列。打开颈部阀门并流过兔网织红细胞裂解液。

通过装置将快速偶联的转录和翻译反应溶液注入DNA室。接着，关闭三明治阀，将每个基因与其环境隔离，并将装置置于30摄氏度的加热板上孵育2.5小时。然后用C mix SI三抗体标记蛋白质的末端终止位点。

最后，使用配备532纳米激光器和575纳米发射滤光片的微阵列扫描仪，测定蛋白质水平。该图显示了蛋白质芯片上不同蛋白质的表达水平。

通常，基因文库中有20%的基因无法表达至可检测水平。背景信号水平是通过未点样DNA的反应室确定的。因此，相应蛋白质反应室中的信号来源于噪声或标记抗体的非特异性吸附。

如果操作得当，设备验证需要四小时，芯片实验需要五小时。