利用原子力显微镜测量活细胞的机械特性

以下实验的总体目标是利用原子力显微镜测量活细胞的弹性模量。首先，在细胞表面多个位置进行调频力谱测量；然后，对每条力-距离曲线进行分析，以确定原子力显微镜探针尖端最初与细胞接触的位置。

接下来，从接触点开始，将前200至300纳米的压痕数据拟合到赫兹模型。为了提取弹性模量，结果将生成一幅通过力图模式获得的细胞刚度二维图，其中每个像素代表一条独立的力-距离曲线。演示该操作的是我实验室的研究生Guen Thomas。开始此操作前，先用70%乙醇清洁悬臂梁支架，并使其自然晾干。

然后根据制造商的说明，将 bru DNP 10 悬臂梁装入原子力显微镜（A FM）。接下来，校准反向光学杠杆灵敏度。该参数描述了悬臂梁每发生一纳米偏转时，光电二极管响应的电压变化量（伏特/纳米）。

首先，将一块洁净的玻璃载玻片装载到样品台上。安装原子力显微镜（AFM）探头，并根据制造商的说明调节激光束和对准。对准完成后，在八氟丙烷（P eight O）撤回的情况下，使AFM探针与玻璃载玻片接触。

将镜面重新调整至光电二极管读数为负二伏。然后进行力谱测量，设置光电二极管的最大响应值或触发点为正二伏。数据采集完成后，放大力曲线的稳定接触区域，并对该区域进行线性拟合。

为求得伏特每纳米的斜率，随后将镜片校准重置为零伏自由偏转状态。接下来，使用Levy和Malam所述的热调谐方法校准悬臂弹簧常数。首先，将扫描器抬离样品台，确保针尖与样品之间无任何相互作用。

然后通过记录悬臂梁的热振动来采集热数据。AFM 软件分析该热振动的功率谱，并在数据窗口中绘制曲线。接下来，对位于最低频率处的数据段进行拟合，该频率也称为基频共振峰，用于确定弹簧常数。

为了准备用于培养皿的 a FM，需在 a FM 载物台上安装培养皿加热附件，并将温度设置为 37 摄氏度。等待 20 分钟，使系统达到稳定的热平衡。预热完成后，将培养皿放置在 a FM 载物台上，并使用加热附件附带的夹具固定。对于超过 30 分钟的测量，应使用不含二氧化碳的培养基替代常规培养基。

接下来，将一滴37摄氏度的培养基滴加到原子力显微镜（AFM）悬臂针尖上，并降低AFM探头，直至针尖刚好浸入液体中。使用顶部CCD相机重新调整激光束在悬臂上的位置。由于培养基折射率的变化，液体中的激光对准位置将与空气中不同。

对齐后，将原子力显微镜（AFM）探针置于培养皿的无细胞区域，并在液体环境中进行反光杠杆灵敏度校准。开始细胞力学性质测量时，在光学显微镜辅助下将悬臂探针定位至细胞的核周区域。通过向X和Y扫描器施加偏移量，实现对悬臂位置的精确调整。

然后将原子力显微镜切换至四光谱模式，并将压痕速率为每秒五微米，该速率足够低，可避免流体动力学效应。接下来，将偏转触发点设置为两纳牛。为避免损伤细胞，应根据样品的刚度调整此数值。

此外，选择相对触发选项，以校正悬臂偏转信号中的任何漂移。然后将力-距离设置为5 µm，以确保在每次力测量之间探针完全脱离细胞。每种条件下，至少对30个细胞的细胞核区域内的不同位置采集三条力曲线。

尽管对每个细胞采集多条曲线是有益的，但为了获得可靠的统计数据，采集过多曲线可能导致细胞因原子力显微镜探针的刺激而发生刚度变化。可进一步采用力图模式来表征单个细胞内机械特性的分布情况。

在力图模式下，将扫描尺寸设置为 30 微米，分辨率为 32 × 32，压痕参数与单个力曲线所选参数相同。原子力显微镜（AFM）将在样品区域的每个像素点采集单个力曲线，并生成整个区域的刚度图。接着，使用 MATLAB 分析记录的力曲线，以计算细胞刚度。

首先采用 Lynette Al 首次发表的算法，该算法使用 MATLAB 从每个数据点计算线性拟合和赫兹拟合。计算两种拟合的相对均方根误差，并在每个点上将这些值相加。选择总拟合误差最小的点作为初始接触点，准确定位该点对于精确测量细胞的杨氏模量至关重要。

接下来，计算样品的形变量 delta。使用以下公式进行计算：在探针与细胞接触之前（即 Z 小于 Z 零）形变量为零；在接触点之后，形变量等于悬臂偏转量 D 与超过接触点的总距离 Z 之间的差值。然后使用以下公式计算压入力 F：在探针与细胞接触之前（即 Z 小于 Z 零）作用力为零；在接触点之后，作用力等于悬臂的弹簧常数 K 乘以接触点之后的悬臂偏转量。

然后将赫兹模型接触后区域的样品形变与压痕力数据应用伊丽丝方程拟合，以根据所示探针形状提取细胞的杨氏模量。以下是分别从三种不同表面培养的三个T3成纤维细胞获得的代表性力曲线。如您所见，不同的表面可显著影响细胞骨架的刚度。

在硬质塑料表面培养的细胞的平均形变以红色显示。在刚性聚丙烯酰胺凝胶上培养的细胞以紫色显示，而在弹性聚丙烯酰胺凝胶上培养的细胞以蓝色显示。通过仔细识别曲线中的接触点，可准确展示压痕力随细胞形变的变化关系。

此外，其杨氏模量可基于接触后前300纳米的压痕深度精确计算得出。图中所示为转染了绿色荧光蛋白标记的中间丝蛋白——波形蛋白（menton）的成纤维细胞。图像越亮，表明该区域的波形蛋白含量越高。

这可能与细胞骨架的刚度有关。利用本视频介绍的原子力显微镜（AFM）力映射技术，可以获得成纤维细胞的刚度分布图，分辨率为32×32像素，每个像素对应细胞表面2.5×2.5微米的区域。观看本视频后，您将清楚了解如何使用原子力显微镜测量活体组织细胞的弹性。