ABC转运蛋白在纳米盘脂质颗粒中的逐步重建方法

本实验的总体目标是将一个A、b、C转运蛋白——此处为麦芽糖转运蛋白Malf GK2——整合到可溶性的膜纳米盘颗粒中。该过程首先将膜支架蛋白MSP与转运蛋白以及适量的脂质在含有去垢剂的胶束中混合完成。

第二步是加入聚苯乙烯珠，并将混合物轻轻振荡过夜，洗涤剂会逐步吸附到珠子上，从而促进纳米盘颗粒的形成。接下来，通过沉降去除珠子。最后一步是通过凝胶过滤色谱法将正确形成的盘状颗粒与聚集体以及未组装的支架蛋白分离开来。

最后，通过天然凝胶电泳或光散射光谱法对盘状结构的质量进行评估。与脂质体等其他方法相比，该技术的主要优势在于膜蛋白和盘状结构在水溶液中具有完全的可溶性。此外，蛋白结构域现在可以从两侧被接触。

由于现在不再使用不同长度的膜支架蛋白来形成膜区室，我能够捕获并研究膜蛋白的不同配体结合状态。最重要的是，该方法有助于解答膜蛋白质组学领域的关键问题，例如鉴定a、b、C转运蛋白的新型结合伴侣。事实上，该技术的影响还进一步延伸至治疗领域，因为它有助于发现膜蛋白和受体的激活剂或抑制剂。

尽管该方法看似简单，但在选择正确的蛋白质与脂质比例时应格外谨慎。通常，初次接触该方法的研究人员在计算正确的摩尔比或设置正确的对照以确保制备质量时会遇到困难。因此，对该方法进行直观的演示，对于初学者掌握各个操作步骤及可能遇到的难点非常有帮助。

从质粒P MSSP 1D1开始，在大肠杆菌BL 21 DE3菌株中表达六组氨酸标签的MSP，当在600纳米处测得的光密度约为0.5时，在37摄氏度下诱导蛋白表达3小时。在4摄氏度下以5,000 ×g离心10分钟收集细胞。将沉淀重悬于含有100微摩尔PMSF的TSG 10缓冲液中，使用法国压菌器在8,000 psi下裂解细胞三次。在4摄氏度下以5,000 ×g离心10分钟去除不溶性物质。然后通过在4摄氏度下以125,000 ×g超速离心45分钟，分离含有MSP的可溶组分。

使用约1.5毫升镍偶联高性能树脂在TSG 10缓冲液中通过镍螯合层析纯化MSP。用含有50毫摩尔ILE的TSG 10缓冲液洗去杂质，再用含有600毫摩尔咪唑的TSG 10缓冲液洗脱MSP，透析后保存。

纯化的蛋白质在TSG 10缓冲液MSP中可于-70摄氏度保存，蛋白浓度约为10至15毫克/毫升。MALF GK二聚体复合物在MAL K的C末端带有组氨酸标签，由质粒表达。PED 22 FG K在大肠杆菌BL 21 DE3菌株中培养，当600纳米处测得的光密度值约为0.5时，加入0.2% L-阿拉伯糖，在37摄氏度诱导表达3小时，随后进行细胞裂解和离心。

与之前相同，将膜沉淀重悬于TSG 20缓冲液中，终浓度为5毫克/毫升。接着，在4°C条件下，用1%（重量/体积）GDM轻柔振荡溶解3小时。通过超速离心去除不溶性物质，方法同MAL FTK 2的纯化步骤。

然后收集含有可溶性 mal FTK 二元复合物的上清液，并用镍螯合柱再次进行纯化。再通过凝胶过滤色谱法在 SUEx 200 HR 10/300 柱上以 TSGD 缓冲液、0.5 毫升/分钟的流速进一步纯化该复合物。制备磷脂时，将溶于氯仿的 E. coli 总脂提取物分装至带螺帽的微量离心管中，每管 1000 异常等分，于氮气流下蒸发溶剂，并在真空条件下继续干燥过夜。

接下来进行干燥，将脂质膜溶解于TS缓冲液中，使其终浓度为5 NMO，充分涡旋混匀，然后脉冲超声处理5次，每次约5秒。由于脂质在水相TS缓冲液中通常不溶，溶解后的脂质溶液会呈现轻微浑浊，但应保持悬浮状态。加入DDM至终浓度为0.5%。此时溶液将变得澄清，将脂质混合物置于水浴中，并脉冲超声处理5次，每次约5秒。

脂质混合物可在 4 摄氏度下最多保存一周。准备生物珠时，将约 10 至 15 毫升生物珠放入 50 毫升离心管中。首先，用 50 毫升 100% 甲醇洗涤珠子。

让磁珠依靠重力自然沉降，然后小心倾去上清液。甲醇中重复此过程一次，随后在95%乙醇、超纯水和TS缓冲液中各重复两次。通过将MSP用TSGD缓冲液稀释至终浓度约为7毫克/毫升或0.3毫摩尔，开始纳米离散结构的构建。

为确保实验成功，选择脂质与蛋白质的正确混合比例至关重要。将约两毫摩尔的纯化 malf GK2 复合物与 MSP 蛋白及脂质按 1:3:60 的比例在 TSGD 缓冲液中混合，终体积为 300 微升。此处，同时以 1:3:400 的比例制备过量脂质样品作为阴性对照。向管中加入 50 微升生物珠悬浮液，并于 4 摄氏度摇床上孵育过夜。次日，通过重力沉降使生物珠沉淀。待生物珠完全沉降后，使用细尖吸头小心吸取上清液，尽量避免吸入生物珠。

通过超速离心在 100,000 ×g 条件下离心 20 分钟，去除大颗粒沉淀物。随后在 TSG 10 缓冲液中按照之前的方法通过凝胶过滤层析纯化膜盘结构。接着，将 Eloqua 注入同一凝胶过滤柱，以检测样品制备物的稳定性。

然后合并含有盘状结构的组分。通过天然凝胶电泳评估制备物的质量。取1 µM的纳米盘用于分析重组效果的质量。

同时评估 mal E 与在纳米盘中重建的 mal ftk 二元复合物的结合。电泳后，用考马斯亮蓝染色 10 分钟，并脱色约一小时。为进行动态光散射（DLS），首先通过凝胶过滤色谱法纯化纳米盘，色谱柱使用 SUEx 200 HR 10/300 柱，流速为 0.1 毫升/分钟，方法同前。

合并含有纳米盘的组分，并使用AmCon离心过滤器浓缩至约10毫克/毫升。然后将样品过滤两次。使用Dynapro Nano Star仪器进行DLS分析，检测所用石英比色皿的内体积为1微升。

使用动态软件估算颗粒的直径和分子量，通过比色法测定mal FTK两种重组纳米盘的ATP酶活性。首先将1微摩尔纯化的纳米盘与1毫摩尔ATP混合，并加入浓度递增的male。将样品在37°C下孵育20分钟。

然后在 660 纳米处测定无机磷酸盐的释放量。将释放的磷酸盐量与使用磷标准溶液绘制的标准曲线进行比较。纳米盘通过凝胶过滤色谱法进行纯化。

色谱图显示，大部分重组后的碟状结构以单一峰的形式洗脱，而使用过量脂质制备的碟状结构则在空体积中洗脱，并呈现一系列宽峰。碟状结构制备质量进一步通过天然凝胶电泳进行分析：使用有限量脂质重组的碟状结构在天然凝胶上迁移为一条清晰的条带，而使用过量脂质重组的碟状结构则迁移为弥散的涂布状条带。动态光散射（DLS）分析表明，碟状颗粒群体均一，平均半径为 5.0 纳米。根据 DLS 的估算，重组碟状结构的表观分子量为 215 千道尔顿；而在过量脂质存在下重组的样品则显示出半径分布广泛，约为 100 纳米，这是非均一性样品的典型特征。

通过测量TP水解速率以及与相互作用伴侣（如麦芽糖结合蛋白MAL E）的亲和力，来评估MAL FTK二聚复合物的活性。MAL E可利用非变性凝胶电泳技术以高亲和力结合MAL FTK二聚转运蛋白。可以检测到MAL E与MAL FTK二聚体之间的复合物，此处展示了MAL E对MAL KA TPA活性的刺激作用随MAL E浓度变化的关系。

纳米盘的制备过程相对简单，但若偏离最佳条件，可能导致蛋白质发生不可逆聚集；一旦掌握，该技术可在不到两天的时间内完成。在进行此操作时，需特别注意选择合适的蛋白质与脂质比例，因为过量的脂质将导致生成大量多分散性的、类似脂质体的颗粒。因此，必须使用除凝胶过滤以外的其他技术（如光散射光谱、分析型超速离心，或更简单的天然凝胶电泳）对重组材料的质量进行仔细分析。

需要指出的是，构成纳米盘的磷脂类型以及膜骨架蛋白的种类均可能影响重组效率。在观看本视频后，我们希望您已充分了解如何制备含有目标膜蛋白的可溶性、均一的纳米盘。祝您的实验顺利成功。