一种简单的成像方法 拟南芥 使用全氟十氢萘作为浸润性成像介质的叶片成像

本实验的总体目标是尽量减少植物叶片中空气腔隙对生物图像造成的降解，从而获得叶内活细胞更清晰的图像。若将叶片置于水性封片介质中，并用激光激发荧光团，则组织内部未被填充的空气腔隙以及橙色所示区域的折射率变化，会限制成像时组织深层信号的强度。若改用全氟化合物（perfluoro deline，PFD）作为封片介质，激光对荧光团的激发衰减更小，可实现发射信号的更佳透射。

最终，使用扫描激光共聚焦显微镜结合PFD封片介质，可获得植物叶片内部活细胞的清晰图像，其成像深度超过使用水性封片介质时的两倍以上。与现有的固定或使用水性介质封片等方法相比，该技术的主要优势在于减少了叶肉组织内部的光折射，从而能够更准确地对叶片深层的活细胞进行成像，而这一问题此前一直存在困难。该方法有助于回答植物科学中的关键问题，例如叶肉细胞生物学及体内信号传导、病原体对叶片的定植过程以及病原体与叶肉细胞间的相互作用，因此该技术可为深入理解植物基础生物学提供重要见解。

该方法也可应用于其他富含气腔且折射率较高的组织，例如昆虫的螺旋气管或脊椎动物的肺。本实验操作将由我实验室的 Dr. George Littlejohn 演示。在 PFD 中制备样品时，首先准备带有气体可渗透垫片的显微镜载玻片，该垫片由聚二甲基硅氧烷（poly dimethyl siloxane）或 PDMS 制成。PDMS 是一种粘弹性聚合物，可塑造成符合特定实验需求的腔室结构。

通过将少量PFD置于装有空气的瓶中振荡，使PFD与空气达到平衡。也可通过向PFD中通入空气实现此步骤，随后将PFD倒入敞口的培养皿中，并将整株幼苗或切下的叶片漂浮于液体表面5分钟。组织应变得半透明，类似于玻璃化组织。

叶片在暴露于PFD后可能显得比之前更暗或更亮，具体取决于光照条件以及所用组织的年龄。最后，用与空气平衡的PFD填充PDMS腔室，并小心地将组织样本从培养用培养皿转移至PDMS腔室中。用盖玻片密封载玻片并进行成像。

根据实验要求，将叶片在重组绿色荧光蛋白（GFP）悬浮液中孵育五分钟。通过PFD显微镜检查经PFD孵育的叶片样品显示，大部分气腔均被悬浮在PFD中的重组GFP充满。GFP呈绿色，红色代表叶绿素、自发荧光以及叶肉细胞的细节。

显然，在与PFD孵育后叶片被液体充满，但偶尔仍会残留一些气袋。在这些条件下，水不会渗入叶片内部。此处，表达Venus（一种定位于细胞质的YFP变体）的opsys叶片被分别在空气、水或PFD中孵育并封片，随后进行激光扫描共聚焦显微镜观察。样品的共聚焦显微成像结果显示，与空气和水相比，使用PFD可使成像深度提高约两倍，具有明显优势。

在比较PFD和水时，一旦掌握，若操作得当，该技术可在5到10分钟内完成。进行此操作时，需注意外周性溶解剂会溶解指甲油和聚四氟乙烯（Teflon），但与硅脂相容。观看本视频后，您应能充分理解如何使用全氟代烷（perfluorodecalin）作为封片介质，以改善植物叶片细胞的成像效果。

请务必注意，尽管聚四氟乙烯无毒，我们仍建议在进行此操作时采取标准的安全防护措施。