通过添加滑石微粒定制Aspergillus niger的形态

该方法通过生成和表征依赖微粒的丝状真菌——曲霉（Aspergillus niger）的形态结构，以关联真菌形态与产率。在三升搅拌罐生物反应器中培养黑曲霉，分别在有或无微粒的条件下培养72小时，以计算比生产率。在规定的时间点取样，测定生物量、干重及β-呋喃果糖苷酶活性。

72 小时后，通过显微镜检查真菌形态，并利用数字图像分析进行表征。然后将图像分析的相关参数组合成一个形态学数值，该数值在数学上与比生产率相关联。最终，该方法可精确生成并全面表征黑曲霉的形态，从而更深入地理解丝状微生物的形态发生过程。

Aspergillus Nigel 数十年来一直是生物技术领域重要的工业用模式菌株。曲霉属、Nigel 及相关物种最引人注目且常难以控制的特征之一，是其复杂的形态结构，会因培养条件不同而呈现从致密球状菌丝球到黏稠菌丝体的多种形式。本方法的主要优势在于，通过添加微颗粒，我们现在能够根据工艺需求定制化调控真菌的形态结构。

迄今为止，尚未有其他方法被报道可用于真菌形态的此类定制化调控。该方法有助于解答关于丝状微生物培养的关键问题。因为在工业应用中，控制真菌的形态至关重要，同时还需要能够区分高产与低产的真菌形态。

本方案提供了对真菌形态进行理想定制与表征的方法。尽管该方法可用于研究曲霉属尼日尔形态，也可应用于其他丝状微生物，如青霉菌或链霉菌菌株。按照配套方案中的详细说明，设置四个用于无菌培养的生物反应器。

基于微粒添加，培养具有不同形态的黑曲霉。72小时后，将50毫升培养液样品转移至Falcon管中。

在干燥器中干燥后，至少取两份生物质样品，用微量天平称量带有纤维素滤膜的滤器。将滤膜置于布氏漏斗中，连接水流抽气泵，先过滤10毫升样品，再过滤10毫升去离子水，以去除生物质中的培养基成分。将滤膜在中间折叠一次。

将其放入玻璃培养皿中，并置于干燥箱内干燥至恒重。将滤膜转移至干燥器中冷却，然后称重。

通过计算滤膜重量差，并除以样品体积，来确定每升培养液的生物量干重，用于葡萄糖氧化酶和过氧化物酶活性测定。使用注射器将1.5毫升样品经醋酸纤维素滤膜过滤至反应管中，过滤过程中保持样品置于冰上，用于进行β-呋喃果糖苷酶（beta fructo SASE）测定。

为确保实验结果的统计学稳健性，我们精心设置了两组三个重复样本。开始检测时，向试管中加入 20 µL 样品；为控制因 pH 和温度依赖性导致的蔗糖水解为葡萄糖，需用 20 µL 去离子水代替 20 µL 样品。此外，针对每个样品，还需通过检测制备阴性对照，以排除培养基中残留葡萄糖的干扰。

取20微升热灭活样品，为启动蔗糖转化为葡萄糖的反应，加入200微升1.65摩尔的蔗糖溶液。在pH 5.4条件下，取20微升样品，将所有反应管置于40摄氏度的加热模块中孵育20分钟。反应结束后，将反应管先在冰上冷却，然后在95摄氏度加热10分钟以终止反应。

必要时离心样品，为使测定的吸光度处于校准值范围内，需对样品进行稀释。现在，向微孔板中每个反应孔加入两微升样品。每个样品需设三个复孔进行测定。

同时为10种葡萄糖溶液准备标准曲线，浓度范围为1毫摩尔至15毫摩尔。零点校准使用2微升去离子水。然后，向每个样品中加入200微升试剂溶液。

室温孵育10分钟。使用96孔Sunrise酶标仪和Magellan数据处理软件在450纳米处测定吸光度。用电子表格打开结果图表，并绘制标准曲线校准线。

计算每个样品的活性，然后通过从样品活性中减去相应阴性对照的数值来计算β-呋喃果糖苷酶活性。最后，结合生物量干重和β-呋喃果糖苷酶活性计算比生产速率。

将三毫升培养液悬液置于塑料培养皿中，并用生理氯化钠溶液稀释，以分离形态结构。显微图像的质量至关重要。为确保后续图像分析的准确性，稀释步骤中需格外注意操作质量。

将培养皿置于配备集成摄像头的显微镜下。每个样品采集并保存约100张形态结构图像，确保每张图像中至少有一个完整的物体。以相同方式继续对含有不同反应器样品的培养皿进行操作，每次均采集新的图像。

注意来自不同反应器的样品在添加不同量滑石粉后表现出的形态生长差异。然后在图像处理程序 Image J 中打开同一份样品的所有图像。使用处理工具将其转换为二值图像。

将图像转换为黑白图像，以便对整组图像应用命令。接下来使用宏代码，打开一张包含比例尺的图片。在比例尺上绘制一条直线，以确定对应于2000微米的像素数量。

选择分析工具，设置测量参数，并选取形状因子、费雷特直径、面积和周长。使用宏代码处理一系列图像。现在打开电子表格，其中绘制了形状因子数值的结果图表。

针对每张图像，使用同一样品的所有图像计算每张图像的形态学数值。计算形态学数值的平均值。使用绘图和数据分析软件将形态学数值与比生产率进行作图。

通过逐步增加滑石微粒的浓度，利用数学回归确定其数学关系。八种尼日尔SKAN 10 15。形态学上，从真正的颗粒形态转变为分散状甚至丝状形态，而在标准条件下则表现出预期的颗粒形态。

有趣的是，通过在培养基中添加每升10克的滑石微粒，可形成菌丝体形态。与此同时，β-果糖苷酶的活性大约增加三倍；而添加每升1克或3克滑石粉则导致分散形态，并使果糖活性加倍，相关参数由自动图像分析确定。这种依赖微粒的形态特征可通过形态学进行系统描述。

形态学数值注释：在显微图像中，呈光滑颗粒状且完全圆形的颗粒会显示为完美的圆形。此类颗粒在标准条件下的形态学数值接近于1。反应器一中的颗粒表现出约0.8的形态学数值。

4号反应器中滑石粉浓度为10克/升时，其形态学数值约为0.1。2号和3号反应器中滑石粉浓度分别为1克/升和3克/升，其形态学数值介于上述两个极端之间，表现出分散的形态特征。

由于微颗粒依赖的形态与β-果糖胞的生产率密切相关，因此在发育完成后，形态、数量与生产率之间存在良好的数学相关性。该技术为生物技术领域的研究人员进一步探索真菌形态及其与生产率的关系奠定了基础。通过采用这种详细构建特定形态真菌交配类型的方法，还可进一步探究丝状微生物培养的其他重要方面。

例如，已知菌丝形态比菌落形态具有更高的黏度。因此，该过程的整体生产效率会因操作问题以及目标产物的纯化困难而受到影响。我们的形态学参数将有助于建立与培养、形态发生学相关的模型，并进一步加深对真菌形态学的总体理解。