评估腺病毒转导的分离啮齿类动物胰岛中的复制及β细胞功能

本实验的总体目标是鉴定调控功能性β细胞质量变化的信号通路。该目标通过在分离的大鼠胰岛中利用腺病毒载体过表达或抑制特定基因的表达来实现。经过上述干预后，通过胰岛素分泌情况评估β细胞功能，并通过氚标记胸腺嘧啶掺入法测定胰岛复制水平。

最终，这些检测可以显示目的基因是否在体外调节β细胞的增殖和/或功能。该方法有助于回答眼睑生物学领域中的关键问题，例如信号通路中的某个特定组分是否影响β细胞的生长和功能？通过向所需数量的孔中加入两毫升改良培养基，准备六孔非组织培养包被板。

例如，一个典型的实验可能需要三个孔，分别用于无病毒对照、病毒对照和实验组。将培养板置于37摄氏度的组织培养箱中预热至少30分钟。在大鼠眼片分离后立即进行操作，将1至200个眼片放入已准备好的培养板的各个孔中。其中60个眼片将用于生化检测，其余眼片可用于基因表达研究或免疫印迹实验。轻轻晃动培养板，使眼片移至各孔中央。

然后立即用移液器将腺病毒直接滴加到培养皿中心的孔中。根据腺病毒在过表达或敲低目标蛋白方面的效率，使用1至500的感染复数。

有效的腺病毒穿透至眼睑核心可提高实验结果的一致性。在眼睑分离后立即进行眼睑转导至关重要。

静置培养板五分钟，期间不要扰动，随后将其放入培养箱中孵育24小时。第二天，从培养箱中取出培养板，轻轻将小孔中的液体吹打至孔中央。使用200微升微量移液器将小孔中的液体转移至含有新鲜培养基的新孔中。

如果小孔与培养板粘连，可用移液器吸头轻轻将其分离。使用表达GFP的对照病毒有助于通过共聚焦显微镜观察腺病毒对胰岛核心培养物的穿透情况，以验证转导效率是否充分。将胰岛继续培养一至三天，每天更换培养基。

培养时间必须通过预实验进行优化，并根据实验目标的不同而有所变化。在最后24小时，将氚标记的胸腺嘧啶核苷以每毫升培养基1微居里的浓度加入培养基中。首先，在50毫升锥形管中新鲜配制50毫升工作浓度的SAB，并在37摄氏度水浴中预热。

移取10毫升工作液SAB至一个15毫升锥形管中，并加入66.8微升2.5摩尔D-葡萄糖。为配制高葡萄糖SAB，向剩余的40毫升工作液SAB中加入44.8微升2.5摩尔D-葡萄糖。为配制低葡萄糖SAB，接下来标记三个1.7毫升微量离心管。

取六孔板的每孔，向各离心管中加入一毫升 PBS。务必遵守机构关于放射性眼状组织的处理与处置规程。使用体视显微镜或普通显微镜，挑选20个大小相近的眼状组织并转移至各微量离心管中。

例如，每个试管可能包含五个小型、10个中型和五个大型的巩膜瓣。尽管实验结果最终将归一化为总蛋白含量，但在各组之间匹配巩膜瓣的大小至关重要。通过重力沉降或离心使巩膜瓣沉降至试管底部后，用微量移液器吸出并称量PBS，然后继续进行巩膜瓣的生化检测前处理。

为胰岛素分泌实验的孔板做好准备，需先用低葡萄糖SAB进行预孵育。操作方法是：向各管中加入400微升低葡萄糖SAB，盖上管盖，放入组织培养孵箱中孵育60分钟。孵育1小时后，吸除预孵育所用的低葡萄糖SAB，以测定基础胰岛素分泌水平。随后重复上述预孵育步骤。

然而，为检测刺激性胰岛素分泌，需使用400 µL高葡萄糖SAB替代低葡萄糖SAB，并将眼状组织在高或低葡萄糖SAB中孵育60分钟。孵育后，吸除SAB并收集用于胰岛素放射免疫分析，该分析将依据试剂盒制造商的说明书进行。随后，使用同一组眼状组织继续进行胸苷掺入实验。起始材料为刚刚完成胰岛素分泌实验的眼状组织。

加入 1 毫升 PBS，静置使眼片自然沉降。然后用微量移液器吸除 PBS。弃去液体，并重复此步骤一次。

接着，向孔眼加入 500 µL 冰冷的三氯乙酸，冰上孵育 30 分钟。在 4 °C 下离心试管。然后吸除并弃去三氯乙酸。

随后，加入 80 µL 的 0.3 N 氢氧化钠溶液，并在室温下孵育样品孔眼 30 分钟。孵育期间，每隔 10 分钟剧烈涡旋振荡样品 5 至 10 秒。同时，向 7 mL 液体闪烁计数管中加入 4 mL 的 COnno 安全计数混合液。

当眼点孵育结束后，将50微升眼点加入闪烁瓶中。短暂振荡盖紧的试管，并在液体闪烁计数器中测定样品的放射性。同时，为测定蛋白质浓度，将10微升眼点转移至商用生物素酸检测试剂盒中，并按照制造商的说明书进行操作。

在后续的数据分析过程中，使用所述方案将结果归一化至蛋白浓度。眼状体增殖与β细胞功能。在大鼠眼状体中，通过腺病毒过表达假设基因6，可显著促进眼状体增殖，且不改变β细胞功能。

基因六的表达增加，通过胸苷掺入法测定显示DNA合成增加，因为大鼠眼状结构中的大多数细胞为β细胞。进一步的实验可能表明，胸苷掺入的增加是由于β细胞复制增加所致。胰岛素分泌检测表明，基因六的过表达并未改变β细胞在低和高葡萄糖条件下胰岛素分泌这一主要功能。

在低浓度和高浓度葡萄糖条件下胰岛素分泌的增加反映了腺病毒处理后胰岛的健康状况。如果基因六的表达增加损害了β细胞功能，则很可能表现为在高浓度葡萄糖刺激下胰岛素分泌减少。观看本视频后，您应能够充分理解如何测定β细胞增殖和胰岛素分泌，以确定特定基因是否影响β细胞的生长或功能。