用于细胞内靶向应用的固体脂质纳米颗粒（SLNs）

本实验的总体目标是合成超小量的生物相容性纳米颗粒，表征其物理特性，并研究颗粒与细胞之间的相互作用。首先采用相变温度法合成脂质纳米颗粒，在此过程中，脂质和表面活性剂最初共同熔融。

加入特定量的水后，将混合物加热至发生相分离。随后持续搅拌混合物，直至形成纳米乳液，且固体脂质纳米颗粒（SLN）的合成完成。接下来，采用动态光散射（DLS）技术测定颗粒大小和多分散性。

差示扫描量热法（DSC）是另一种用于测定熔点和熔融潜热的技术，可进一步表征颗粒。最终，荧光显微镜和流式细胞术可用于研究颗粒与细胞之间的相互作用。与现有的高能方法（如超声处理、微流控和高压均质）相比，该技术的主要优势在于其是一种相对温和的合成方法，既简单又具有可扩展性。合成LNS时，将0.6毫克荧光染料或其他亲脂性化合物与0.10克直链烷烃或脂质混合。

在15毫升小瓶中，将组分于90摄氏度下核心熔化并搅拌，加入0.11克线性非离子表面活性剂。然后将所得混合物在90摄氏度下熔融并搅拌。接着，向混合物中加入1.79克无菌水，加热至90摄氏度，并目视监测溶液，直至观察到两相。

现在搅拌混合物，直至形成透明的纳米乳液。同时制备另一份不含荧光染料的纳米乳液作为对照样品。随后使用无菌的0.2微米滤器对每种纳米乳液进行进一步灭菌。

使用动态光散射（DLS）技术，通过玻璃样品池在仪器中测定S lns的粒径及其多分散性。在测量样品之前，应先按照制造商提供的标准品制备和测量方案，测定两种已知标准品的粒径，以验证仪器性能。随后，依次测量各制备好的样品。设定运行时间为100秒，采用水的折射率以及20摄氏度时水的黏度进行计算。

报告平均粒径和粒径分布的多分散性，以研究SLNs的热行为。首先使用DSC，用移液器将SLNs转移至质量约为25毫克的40微升铝坩埚中。使用通用压盖机将坩埚密封，以尽量减少DSC扫描过程中的水分流失。在测量每种纳米乳剂时，温度范围为5至80摄氏度，从DSC曲线图中报告熔点及熔融潜热，其中谷值代表熔点，曲线下方面积的积分代表熔融潜热。

在DSC图谱中，除以材料量表示熔融相变的潜热。按照制造商的说明，将原代人成纤维细胞接种于人皮肤成纤维细胞培养液中。添加低血清生长补充剂，在37°C、5%二氧化碳的湿润环境中培养细胞，并在细胞融合度达到80%时进行传代，用于后续MTT检测和成像分析的细胞接种。

在96孔板中以每孔20,000个细胞的密度接种。将细胞在37摄氏度下孵育过夜，使其达到平衡状态，然后在零时间点暴露于SLN。将SLMs用完全培养基稀释至所需脂质浓度，每孔加入10 µL，分别添加至96孔板的各重复孔中。与SLNs孵育24小时后，按照制造商的说明书采用MTT法测定细胞活力。洗涤细胞一次，并向每孔加入100 µL新鲜培养基。

将对照孔用70%甲醇溶液孵育10分钟以终止细胞生长，随后更换为新鲜培养基。向每孔微孔板中加入10微升MTT试剂，37摄氏度孵育过夜。经过过夜孵育后，每孔加入100微升提供的去垢剂溶液，以溶解细胞内形成的甲臜晶体。根据制造商说明书，将细胞在去垢剂溶液中于室温孵育3小时，然后测定吸光度值。

使用微孔板读数仪为显微镜观察做准备。用无菌磷酸盐缓冲液洗涤成纤维细胞两次。在成纤维细胞给予l ns处理后的特定时间点，用冰冷的70%甲醇固定细胞10分钟。

孵育10分钟后，在使用倒置显微镜采集图像前，将甲醇替换为磷酸盐缓冲液（PBS）。所制备的S型SLN得到平均粒径为18.59纳米、多分散性为5.83的空白S LNS，以及载有尼罗红的SLM，其平均粒径为16.87纳米，多分散性为4.47，通过MTT法测定。通过测定细胞代谢的剂量-反应效应，发现随着颗粒浓度的增加，细胞活力下降。

单独暴露于SLN与暴露于载有尼罗红的SLN之间，细胞毒性未观察到明显差异。同时，通过显微观察评估细胞在组织培养板上的贴壁情况，并采集聚苯乙烯表面的图像，以展示随时间推移具有代表性的细胞形态及荧光颗粒的摄取情况，所用剂量为每毫升5微克。

暴露后两小时观察到脂质颗粒的摄取。通过流式细胞术检测尼罗红荧光强度，测定小鼠骨髓来源树突状细胞（B MDCs）对纳米颗粒的摄取水平。观察到所使用的SNS浓度与B MDCs中检测到的荧光量之间存在直接相关性。

观看本视频后，您应能够充分理解如何合成超小量的生物相容性纳米颗粒，表征其物理特性，并研究纳米颗粒与细胞之间的相互作用。