大鼠脑表面血管系统及相关脑膜和脉络丛的解剖可视化描述

本实验的总体目标是高效且快速地分离覆盖在前脑皮层和中脑、丘脑以及胼胝体表面的脑膜软膜层和蛛网膜部分及其相关的动脉血管系统，同时从侧脑室中采集脉络丛组织。该目标通过以下步骤实现：首先，移除松果体，并将包裹前脑的脑膜及动脉树状结构分离；其次，从腹侧的威尔斯环开始，仔细清除皮层表面的动脉和小动脉，然后逐步向背侧皮层表面推进，使软膜及残留的蛛网膜尽可能与血管系统保持附着，同时确保最大限度减少邻近皮层表面组织的采集。

接下来，将皮层和连合纤维从隔区和海马体上分离，暴露侧脑室，以便采集脉络丛。最后，移除海马体，暴露丘脑和中脑胼胝体。随后解剖该区域表面的脑膜及其相关血管结构。

最终，通过比较这些区域各自的基因表达谱，可以确定分离出的脑膜及其相关动脉血管以及脉络丛的完整性和特异性。该方法有助于回答与支持脑功能的血管系统相关的研究中的关键问题，包括脉络丛与脑膜及其相关动脉血管在血流、脑脊液功能、神经毒性损伤和脑外伤等方面的功能相似性、比较及差异。

开始本实验方案时，将安乐死后立即取出的大鼠脑组织置于冰上预冷的生理盐水中，持续五分钟。在解剖前让脑组织冷却足够的时间至关重要，以便能够将脑表面的四层脑膜及其相关的动脉血管系统（MAV）从大脑皮层表面分离。接下来，将脑组织放入一个置于冰上的玻璃培养皿底部，培养皿中加入一厘米深的冰上预冷的生理盐水或 pH 7.4 的 0.1 摩尔磷酸盐缓冲盐水（PBS）。

所有解剖操作均应在脑组织大部分浸没于生理盐水的条件下进行。开始解剖时，将脑背侧朝上置于培养皿中，找到位于两半球之间最尾侧腹区的松果体，其位置紧邻小脑前方，且位于脑膜表面或稍下方。

在丘脑上方，使用两把小型弯头镊子摘除松果体。注意松果体呈粉红色，与皮层颜色相似，但通常周围残留有脑组织取出时留下的血液和血管组织。

接下来，将培养皿中的脑组织翻转至背面向上。然后分离覆盖在脑桥上的椎动脉、细小动脉以及脑膜与前脑的脑膜和血管结构。随后，开始移除MAV。

在解剖过程中，首先应从腹侧开始，处理大脑动脉环的主要动脉，包括大脑中动脉和大脑前动脉。接着，从一侧半球开始，使用小弯头镊子在颈内动脉连接处后方切断后交通动脉，从而分离前脑的前部和后部动脉分支。然后对对侧半球重复相同的操作过程。

现在用镊子夹住大脑中动脉（MCA）和前动脉，轻轻向腹侧前方向牵拉，使覆盖在腹侧前皮质的软脑膜血管网（MAV）被抬起并翻转至嗅束上方。这样可去除覆盖前皮质的大部分MAV。将脑组织在培养皿中旋转至与水平面呈45至90度角，以便松解围绕外侧皮质区域的MAV中外侧且更靠前的部分；夹住MCA及其伴行动脉，沿皮质表面轻柔地向背侧牵拉。

如有必要，可在解剖过程中使用镊子的尖端抬起并分离皮层中的主要动脉。现在，移除 MAV 更靠后方的外侧区域。请注意，在此收获过程中，最好在两个半球之间交替操作，以确保 MAV 保持低温和湿润；如果在分离 MAV 与皮层时遇到任何阻力，也应切换至另一侧半球。

最后，为了去除覆盖初级躯体感觉皮层和运动皮层的脑膜血管（MAV）最背侧区域，将脑组织背侧朝上，用镊子沿矢状窦末端分离该部分脑膜。采集到的这部分MAV可暂时保存在冰冻生理盐水中，待后续检测与分析时使用，也可冷冻保存以备后续处理。通常，覆盖大脑皮层最尾侧区域的MAV仍会保持附着状态。

其去除过程将在本视频的后续部分展示。要移除脉络丛，首先将脑组织背侧朝上放置，并用较大的镊子固定。然后将较小的镊子沿半球间的中线向下推进，利用镊子尖端刺穿皮层和胼胝体，进入海马中线的顶部。

接下来，使用镊子将带有胼胝体的皮层从背侧海马和隔区拉开，以暴露大部分侧脑室。脉络丛可通过其全长走行的主要动脉所呈现的波浪状红线进行定位和识别。使用镊子的两端撬开第三脑室的侧壁，并在其最尾端将其扩大。

然后使用小镊子将脉络丛的这一端游离出来。接着，用镊子扩大隔区与尾状壳核区域之间的最前部，并在此端也将脉络丛完全游离。同样地，在对侧半球重复相同操作，以获取第二个残留的脉络丛。

同样，该组织可暂时保存在冰上、冷盐水中，或冷冻以备后续处理。为去除覆盖在皮层最尾侧区域的残留脑膜血管（MAV），首先需将双侧半球的海马体完全移除，从而暴露丘脑和顶盖上方的MAV。需要注意的是，与从皮层去除MAV相比，去除这部分MAV的难度将显著降低。

通过抓握覆盖在丘脑前部的较大血管，并轻柔地向外牵拉，该血管与上脑室周围网络相连，为背侧海马和背侧丘脑网络供血。继续轻柔牵拉，最终可松解上脑室周围网络，从而到达尾状动脉环的最后部分。此时需更加小心，以清除颗粒样后直线初级听觉皮层和视觉皮层表面残留的任何微小动脉血管（MAV）。

若在获取第二部分丘脑和胼胝体MAV组织时同时收获了任何残留的后腹侧皮层MAV组织，应将其去除，并加入此前分离的第一部分皮层MAV组织中，以便分别进行分析。接下来，为在对照条件下比较纹状体、顶叶皮层与MAV区域之间的基因表达谱，可采用Agilent 0 1 4 8 7 9全大鼠基因组4×44,060 mer寡核苷酸芯片进行基因表达分析。有关样本处理、扫描及初始数据存储的更多细节可参见Thomas等人的研究。

当解剖操作正确执行时，所获得的 MAV 组织应为两个完整的部分，总重量约为 35 至 45 毫克。最初解剖得到的、覆盖大部分皮层的 MAV 组织重量应约为 25 毫克，而覆盖丘脑、胼胝体和枕叶皮层的 MAV 组织重量应约为 15 毫克。

组织因血管中残留的血液而呈现微粉红色。采集的双侧脉络丛应为两份完整的组织样本，每份重约一至二毫克，如图所示。此处展示了在对照条件下纹状体、顶叶皮层和 MAV 的基因表达谱比较。

上方图表显示了纹状体与顶叶皮层相比的基因表达情况。下方图表显示了MAV与顶叶皮层相比的基因表达情况，可以看出，纹状体与顶叶皮层之间的基因表达关系比MAV与顶叶皮层之间更为接近。此处我们观察到MAV在高热条件下相对于对照组、安非他明处理相对于对照组，以及高热相对于安非他明处理时的差异性基因表达情况。

最后，此处显示的是与顶叶皮层和纹状体相比，在MAV中表达水平高出15倍以上的基因，这些基因按其功能进行了分类。这些基因中的许多与血管系统和/或免疫系统相关。其他具有显著高倍数变化的基因包括细胞外基质蛋白、溶质转运蛋白，以及脂质和视黄酸代谢相关基因。

在进行该操作时，需要注意在解剖 MAV 时保持耐心。在整个解剖过程中，必须始终使脑组织浸没在等渗盐水或磷酸盐缓冲盐水之中。此外，建议在获取用于产生实验数据的组织之前，先在四到五只大鼠身上练习 MAV 的切段操作。