高效生产与纯化用于生物物理研究的重组小鼠Kindlin-3蛋白（源自昆虫细胞）

以下实验的总体目标是利用昆虫细胞培养系统高效地生产毫克级的Miran Kinlin三号蛋白，该蛋白无法在其他表达宿主中获得。通过共转染技术，将KINLIN三号转移载体与经过改造的杆状病毒辅助质粒共同导入昆虫细胞，从而构建携带KINLIN三号基因的重组杆状病毒。第二步是在昆虫细胞内扩增该病毒，以产生足够数量的病毒粒子，用于后续实验步骤。

接下来，感染昆虫细胞以大量生产Kinlin三号蛋白，从而通过快速液相色谱法进行纯化。实验结果表明，基于SDS-PAGE分析和尺寸排阻色谱，可获得毫克级产量的高纯度、具有功能活性的Kinlin三号蛋白。该技术相较于现有方法（如在细菌中表达Kindling三号蛋白）的主要优势在于，杆状病毒感染的昆虫细胞表达系统可使重组蛋白产量提高十倍。

本实验所用的SF9细胞采用添加了100微克/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的SF902培养基进行悬浮培养和维持。为生成bao病毒，细胞应培养至密度为每毫升5×10⁵至1×10⁶个细胞的范围。为准备转染用的SF9细胞，将约每孔1×10⁶个细胞接种于无菌六孔组织培养板中，每孔加入2毫升添加了青霉素和链霉素的SF902培养基，在超净台中室温静置约20分钟，使SF9细胞贴附于塑料孔底部，从而形成单层细胞。重组balo病毒的生成是通过将质粒DNA与BMid DNA共转染至单层SF9细胞培养物中实现的。

表达载体 papine 神经元 firm T three 含有小鼠 KINLIN three 基因 firm T three。该载体在 P 10 BAO 病毒启动子的调控下，具有侧翼的 bao 病毒序列，可与 back mid 发生重组，并编码一个 C 末端的 hiss six 标签，用于后续纯化。每次转染使用 1 至 2 微克纯化的 MFI T three、0.5 微克纯化的 B mid 以及 100 微升不含抗生素的 SF 902 SFM。此为溶液 A。在另一支试管中，将 6 微升 cell effect in two 试剂用 100 微升不含抗生素的 SF 902 SFM 稀释。

若需进行多次转染，可在此为每轮转染反应配制总混合液，以减少液体操作步骤。此为溶液B。每轮转染取约200微升溶液A与200微升溶液B混合，在室温下孵育20分钟，以形成脂质-DNA复合物。20分钟后，每轮转染加入800微升不含抗生素的SF-902 SFM培养基稀释脂质-DNA复合物。随后，小心吸除SF-9细胞单层的培养基，并小心地将AB溶液与培养基的混合液滴加至SF-9细胞单层表面。

将转染后的细胞置于湿润的培养箱中，在27摄氏度下孵育过夜，以建立湿润环境，防止细胞干燥。将六孔板放入塑料容器中，并放置一张湿润的纸巾。次日，向每孔单层培养物中加入额外1毫升不含抗生素的SF 900培养基，继续在27摄氏度下孵育细胞5天。

培养五天后，直接从培养基中收获重组杆状病毒，并转移至洁净的离心管中。通过在室温下以1000 ×g离心5分钟，去除SF9细胞碎片。将上清液（即P1代病毒）转移至新的洁净离心管中。P1代病毒的滴度通常可达每毫升1×10⁷ PFU。

尽管在需要时可进行噬斑SA，但应将P病毒储备液在避光条件下于4摄氏度保存直至使用。用于悬浮培养扩增重组杆状病毒的SF九细胞密度应为每毫升1.4×10⁶个细胞，培养液体积应占培养瓶总体积的二十分之一。例如，在2升培养瓶中加入50毫升培养液。通常情况下，为获得最佳的病毒扩增效果和蛋白表达，SF九细胞应大小均一且呈球形。

使用以下公式，以0.1的感染复数（MOI）用P1病毒原液感染SF9细胞培养物。将感染P1的昆虫细胞培养物在27°C、100 RPM振荡条件下孵育72小时。三天后，通过在1000 ×g离心5分钟，将细胞与培养基分离，收集病毒。

在室温下转移澄清的病毒富集培养基至洁净离心管中。该病毒储备液记为P2代，预期病毒滴度为2 × 10⁸ PFU/mL。将该病毒储备液置于4°C避光保存直至使用，同时将获得的细胞沉淀在-20°C保存，用于后续重组病毒产生的确认。

开始此操作步骤时，需在悬浮培养基 SF 902 s fm 中培养足量的 SF nine 细胞，培养基中添加 100 微克/毫升青霉素和 100 微克/毫升链霉素。总体培养液体积与培养瓶体积之比应为 1:5。

将悬浮培养物在27摄氏度、100 RPM振荡条件下培养，直至细胞密度达到2 × 10⁶ 个细胞/毫升。当SF9细胞培养物达到2 × 10⁶ 个细胞/毫升的密度时，即可用于杆状病毒感染。向培养物中补充胎牛血清至终浓度为1%，随后加入P2代病毒原液。

为了获得感染复数（MOI）为1的条件，将感染后的培养物在27摄氏度下以100转/分钟（RPM）振荡培养72小时。感染72小时后，于室温下以1000 ×g离心20分钟，收集表达重组多聚组氨酸标签Lin3蛋白的SF9细胞。将所得细胞沉淀物储存在-20摄氏度下以备短期使用，或储存在-80摄氏度下用于长期保存。本实验操作从冰上解冻开始。

将感染了vao病毒并表达重组kinlin three的SF九细胞的冷冻沉淀用裂解缓冲液重悬。将重悬的细胞与裂解缓冲液在5至10分钟内孵育，涡旋振荡直至形成均匀的重悬液，以进行后续的细胞破碎。将样品置于冰浴中进行超声处理。

在4°C条件下，以48,000 ×g离心一小时，澄清裂解液。将所得上清液以每分钟1毫升的流速上样至预先用4°C裂解缓冲液平衡的5毫升体积组蛋白捕获柱（Histrap column）中。此处不演示后续的蛋白洗脱、缓冲液置换及蛋白浓缩步骤，相关细节请参见随附的论文。

获得缓冲液置换后的蛋白质溶液后，将其以每分钟0.5毫升的流速上样至预先平衡的5毫升体积High Trap Heparin HP柱，使用ACTA FPLC系统进行操作。通过在相同缓冲液中以每毫升10毫摩尔的速率递增的线性氯化钠梯度洗脱结合的KINLIN three。预计KINLIN three在约0.6摩尔氯化钠浓度下被洗脱。蛋白质浓缩后，最后一步是通过尺寸排阻色谱进行缓冲液置换，将纯化的蛋白质上样至SUEx S 210 30柱，并以每分钟0.5毫升的流速将缓冲液加入柱中，根据蛋白质分子大小进行纯化。

从层析柱洗脱的蛋白质通过在280纳米波长下检测吸光度进行分段收集和监测。通过SDS-PAGE和Western印迹分析检测重组KINLIN3蛋白以及共转染的SF9细胞中是否存在目标蛋白，从而验证重组病毒的生成是否成功。如本图所示，在使用抗His6抗体进行检测的6个小型SF9细胞培养样本的代表性Western印迹结果中，当病毒经扩增并用于大规模感染SF9细胞后，每个样品均可见一条对应于75千道尔顿的His标签蛋白的清晰条带。重组KINLIN3蛋白随后通过固定化金属螯合亲和层析进行部分纯化。

本图中的主凝胶图像显示了在杆状病毒感染的SF9细胞中表达的重组小鼠kinlin 3蛋白经镍亲和层析纯化后的SDS-PAGE结果。凝胶上方所示的蔗糖梯度用于蛋白的吸收。MW表示分子量标记物，LYS为全细胞裂解液，FT为流穿组分，WI为第一次洗涤，WII为第二次洗涤。此外，还对洗脱组分进行了蛋白质印迹分析，以确认重组蛋白上存在设计的6×His标签。

接下来，将部分纯化的KINLIN三通过肝素柱离子交换色谱进一步纯化至接近均一。该图上部显示了在280纳米处检测到的洗脱曲线（蓝色），呈现为单一的对称峰，在绿色所示的线性氯化钠梯度下洗脱，氯化钠浓度范围为0.05摩尔至1.0摩尔。下部图显示了分段洗脱组分的SDS-PAGE分析结果，证实存在分子量为75千道尔顿的蛋白Kinlin三。

最后一步，通过尺寸排阻色谱对KINLIN三纯度进行精制，以去除聚集体并实现均一性。该代表性凝胶过滤洗脱谱图采用SUEx S 200柱，在Tris HCL pH 7.5、150毫摩尔氯化钠和1毫摩尔DTT、20摄氏度条件下对纯化的Kinlin三进行测定。根据洗脱体积，KINLIN三的迁移行为符合预期的75千道尔顿蛋白，表明其主要以单体形式存在。

下图显示了高浓度纯化的重组小鼠KINLIN3（标记为K3，浓度为14.5毫克/毫升）的SDS-PAGE结果。大量制备高纯度、全长的小鼠KINLIN3蛋白，并在昆虫细胞培养系统中实现，将有助于对该蛋白开展深入的结构研究和生化分析。本研究还进行了基于热移的热稳定性分析（thermo shift assay），以确定哪些缓冲体系对KINLIN3蛋白具有稳定作用。

KINLIN 三被稀释到各种缓冲液中，构成一个 pH 值与氯化钠浓度的二维筛选实验。上方图显示的是转变温度的三维直方图，下方图显示的是相对于计算平均值 50.4 摄氏度的转变温度变化。柱状图根据其所对应的温度范围进行着色。

KINLIN 三在 7.0 至 9.0 的 PA 范围内高浓度氯化钠条件下表现出稳定性，且转变温度恒定为 55 摄氏度。还观察到，在 PA 范围为 7.0 至 7.5 时，无论氯化钠浓度如何，KINLIN 三的转变温度均约为 55 摄氏度。

观看本视频后，您应能充分掌握如何制备高纯度、具有功能活性的重组型kindling蛋白，用于深入的生物物理表征及后续研究。对于其他难以制备的蛋白质样品，也可采用类似方法，我们推荐在此类情况下应用该技术。