库普弗囊泡中基因功能分析及纤毛驱动液体流动的可视化

本实验的目的是通过向斑马鱼胚胎的卡瓦氏泡（KV）中递送荧光微珠，调控KV中负责左右体轴模式形成的基因功能，并分析由运动性纤毛产生的不对称液体流动。该过程首先将荧光标记的形态发生素寡核苷酸注射到中等囊胚期胚胎的卵黄细胞中，以抑制特定目标基因的表达，使其进入将发育为KV的背侧前导细胞。随后筛选出仅在卵黄细胞和KV中具有荧光标记形态发生素的注射胚胎，用于后续分析。

然后将胚胎置于凹面载玻片上，并将荧光微球注入充满液体的Kupffer's vesicle（kv）腔内。最后，利用视频显微镜记录微球在kv内部的流动情况。最终，通过定量分析微球的运动，可以获得结果，以确定在Kupffer's vesicle中特异性敲降候选基因是否会影响不对称性液体流动。

本学期的病毒演示至关重要，因为特定发育阶段的摩利诺注射和荧光微珠注射较难掌握，二者均依赖于胚胎的定位以及实验的发育时间点。为了进行全胚形态发生素或吗啉代寡核苷酸（MO）注射，需在受精后立即收集胚胎，并将其加载到注射板中。使用经火焰抛光的巴斯德移液管将胚胎放入注射板，以固定胚胎。

折断注射针的尖端，并调整注射参数，使注射液滴的体积为一纳升。在解剖显微镜下，将一纳升的吗啉代寡核苷酸（MO）注射到至少50个处于单细胞至四细胞期胚胎的卵黄中。对于DFC靶向的M吗啉代注射，需在受精后立即收集胚胎，并在28.5摄氏度下孵育。

当胚胎发育至256细胞期时，迅速将其装载到注射板中，并向卵黄内注射1纳升荧光标记的吗啉代寡核苷酸（MO）。为实现卵黄靶向注射，需在256细胞期至1000细胞期之间对至少100个胚胎进行注射。将受精卵培养至囊胚期后，在囊胚期至30%原肠胚形成期之间，对至少100个胚胎的卵黄部位注射1纳升荧光标记的吗啉代寡核苷酸（MO）。

当M摩尔注射的胚胎发育至75%原肠胚阶段时，在体视显微镜下移除未受精和死亡的胚胎，用于全胚胎MO注射。选择荧光在所有细胞中均匀分布的存活胚胎。

对于靶向DFC的Moz敲低寡核苷酸（MO）注射，应选择荧光在整个卵黄中弥散分布并集中在背侧外胚层边缘的胚胎。对于靶向卵黄的MO注射，应选择荧光在卵黄中均匀分布且在2至4细胞期之间未见于任何胚胎细胞中的胚胎。

因此，选择仅在KV细胞和卵黄中显示荧光的DFC靶向胚胎，用于卵黄靶向注射，并弃去其余胚胎。选择荧光仅局限于卵黄的胚胎，以分析MO注射胚胎中KV内的不对称流体流动；首先使用尖头镊子小心地在4到6个胚胎之间进行操作，共处理约20个胚胎。

可将多个胚胎转移至玻璃凹面载玻片上，并尽可能吸除多余水分。加入足量温热的1%低熔点琼脂糖，刚好覆盖胚胎，待琼脂糖凝固以固定胚胎。用镊子调整胚胎位置，使克利夫兰腔（KV）朝上，每次固定10个胚胎，并迅速操作，确保所有注射在10分钟内完成。

因此螨虫阶段。将直径为0.5微米的荧光微珠用无菌水稀释至1:50。充分混匀微珠后，使用与MO注射相同的显微注射器，取3微升加入毛细玻璃针中。

使用镊子折断针尖，并调整注射参数以产生尽可能小的注射液滴。接着，在解剖显微镜下，将针头对准第一个固定好的胚胎的KV腔。然后将针头插入腔内，注入少于0.5纳升的微珠。

在琼脂糖上滴加一滴无菌水，以防止胚胎在直立式荧光显微镜下干燥。使用 20 倍物镜筛选已成功注入微珠的胚胎，选择微珠位于卵黄囊（KV）内的胚胎，并用一滴无菌水覆盖琼脂糖。然后使用 63 倍水浸物镜在荧光复合显微镜下进行观察。

使用安装在显微镜上的高速相机录制一段10秒的视频。利用荧光通道以每秒约70帧的速度记录微珠，同时使用明场或微分干涉差（DIC）成像记录KV腔。将视频导入ImageJ软件，生成最大强度投影，并使用该软件追踪各个微珠的运动轨迹。

该图展示了在成功进行阶段特异性活体注射的胚胎中荧光吗啉代寡核苷酸（MO）的分布情况。此处显示的是注射失败的情况，即溶液仍聚集在卵黄细胞中。在具有正常流动微珠的对照胚胎中，可对成功注射胚胎中的液体流动进行定性或定量测量。

通过随时间对荧光微珠位置进行最大投影，或随时间追踪单个微珠，可观察到逆时针流动路径。为验证协调性流动的丧失，实验中向胚胎注射吗啉代寡核苷酸（MO）以敲低rock two B（row kinase two B），该处理会破坏正常流动，导致微珠在Kupffer's vesicle（kv）中随机移动。此处展示了对照组与rock two B吗啉代寡核苷酸处理组胚胎中五个微珠的平均运动速度。该技术为发育生物学领域的研究人员探索斑马鱼左右体轴建立过程中的基因与机制奠定了基础。