利用微流控探针快速减法图案化活细胞层

本视频文章所介绍方法的主要目标是快速生成具有空间定义的细胞图案，以促进对细胞间相互作用的原位时空分析。该策略利用微流控探针技术，通过微加工探针头在生物基底上对纳升级体积的生化物质进行定位，从而实现细胞单层的图案化。

基于MFP的图案化技术的主要优势在于其几乎可以瞬时完成，这得益于局部裂解作用，从而能够实时调整所生成的图案。我们最初产生这一方法的想法，是由于注意到其他生成细胞图案的方法在真正观察到细胞图案的成功形成之前，需要经历漫长且多步骤的实验流程。为了在细胞表面利用流体动力学流动限制进行稳定的实验，需要对MFP参数进行优化。

为此，视觉演示至关重要。Aditya Kashyap 和 Julien Cors 将演示该操作流程。该平台的操作模块包括电动注射器、电动载物台和控制器。

微流体探针（MFP）连接至电动Z轴平台，用于控制探针头与基底之间的间隙距离，基底支架则连接至X轴和Y轴电动平台，构成扫描系统。MFP探针头设有流体通路，可连接至泵站，还设有安装孔，用于将探针头固定在Z轴平台上，以及通向抛光尖端出口的通道。该尖端与细胞培养基底保持共面。

为准备泵站和流体处理装置，在活细胞实验前和实验后，需将注射器和注射器推杆在超纯水中用超声波清洗，并用0.5%次氯酸钠溶液处理。随后用清水彻底冲洗。将注射器尖端完全浸入水浴中，通过拉动推杆吸取水，从而将注射器充满水。

在水浴中操作，使注射器针筒末端接触注射器出口处的密封圈，排出液体。持续抽吸和排出，直至注射器内无可见气泡。使用下锁式连接器将装满液体的注射器连接至注射泵。

使用安装在泵上的切换阀，将注射器中的液体导向两个毛细管之一，分别通向MFP探头或液体储液池。根据注射器的大小，以每分钟约10至50微升的流速用注射器中的水冲洗两个毛细管，直至注射器中剩余约10微升水为止。通过超声处理清洗MFP探头，常规清洗使用玻璃器皿清洁剂，严格清洗则使用0.5%次氯酸钠溶液，清洗时间为5分钟。

将尖端浸入水中，并对通孔施加真空，用水冲洗通道。在体视显微镜下检查通道是否存在潜在堵塞，如有必要，重复上一步骤。随后，将清洗后的头部安装到头部支架上，并将连接器旋紧至头部。

将已吹洗的毛细管插入合适的微流控连接器适配器中，该适配器与头部的通道通孔相连接。在执行终点校准之前，将头部固定器拧紧至Z轴平台，用于控制头部与细胞单层之间的间隙距离，具体校准步骤如文本方案所述。通过将MFP头部移至无细胞的腔室载玻片上方，并以每步5微米的幅度缓慢下降，获得粗略的零间隙距离。

当探针与基底接触时，应观察到牛顿环。这是一种粗略的估计。准确的位置应在调整探针尖端与基底的共面性后获得。

形成牛顿环时，应确保其呈对称分布。为保证探针尖端共面，通过位于探针头与Z轴平台接口处的测角仪调节探针头的倾斜角度。将微流控探针（MFP）头从基底表面移开20微米，然后使用测角仪进行倾斜调节。

重复进行下降、归零和倾斜度调节，直至牛顿环在接触时呈对称状态。调节好倾斜度后，将产生对称牛顿环的Z轴位置设为零。接下来，按照文本方案中的描述，准备用于内注射通道的处理液以及外注射所需的提取缓冲液。

使用排液管连接至注射泵，以每分钟40微升的速度排空残留的水，并将脱气后的溶液吸入注射器中，直至注射器充满。这可确保注射器、连接头和毛细管在填充过程中无气泡。为制备腔室载玻片上的细胞单层，需按照标准细胞培养方案在T形瓶中扩增细胞。

当培养瓶中的细胞达到汇合状态时，用胰蛋白酶消化并收集细胞。将每平方厘米0.2×10⁶个细胞接种至双室载玻片的每个腔室中用于图案化。培养细胞48小时，其中一个腔室的细胞作为细胞生长和活力的对照。

当腔室载玻片上的细胞达到汇合状态时，在无血清培养基中加入500微升浓度为10微摩尔的细胞示踪染料溶液，孵育细胞45分钟，以用于后续图案化过程中的细胞观察。使用移液器轻轻冲洗每个腔室，以PBS洗涤标记的细胞。

随后，将细胞在添加血清的培养基中培养，用于图案化实验。流体动力学流动限制通过同时注入和抽吸处理液来实现液体的局部限定。在分级限制结构中，多种处理液被分别限定，其中外层HFC保护样品免受内层处理HFC的影响。

将MFP移至细胞单层上方，使其与玻片之间的距离为50微米。此间隙距离可确保分级HFC的有效接触，同时兼顾单层表面及厚度的差异。通过I-two以每分钟六至八微升的速度注入氢氧化钠。

使用文本方案中的流速规则评估其他流速。通过调节进样注射器的进样流速 QI-two 与 QI-one 的比例，来调控内相 HFC 的尺寸。例如，将 QI-two 固定在 8 µL/min，QI-one 在 1.3 µL/min 至 4 µL/min 之间变化，以获得包含 150 至 300 个细胞的氢氧化钠分布区域。

为补偿培养基在人源高通量培养装置（hHFC）运行过程中的蒸发和吸取，在MFP探头最外侧孔径中以每分钟20微升的流速注入完全培养基。为实现细胞单层的图案化，将载物台软件设置为以每秒10微米的扫描速度和50微米的间隙距离，按照用户自定义的图案驱动探头在细胞单层上进行扫描。当嵌套式hHFC处于工作状态并与单层细胞接触时，沿所需图案轨迹扫描MFP，以实现细胞的选择性去除。

在去除第一种细胞类型后进行共培养时，接种另一种细胞系以填补空缺，方法同前。准备用于裂解液下游分析的取样工作站。图中所示为一个取样工作站示例，包含一个三维打印的八联PCR管条架。

根据应用所需的严格程度，使用70%乙醇或其他表面去污剂擦拭管架。使用磁性夹将管架固定在基底架上。准备完采样站后，将MFP探头置于距离单层细胞100微米的位置。

使用50毫摩尔的氢氧化钠溶液作为内注射通道的处理液，以1微升/分钟的流速用于QI-1，6微升/分钟用于QI-2，-7微升/分钟用于QA-1，以及-17.5微升/分钟用于QA-2，开始操作hHFC。一旦流动限域稳定，将探针头下降至50微米的间隙距离，利用hHFC对选定的细胞亚群进行基于氢氧化钠的局部裂解。当该细胞亚群裂解完成后，将探针头移向采样站中的管路。

将收集的裂解液直接弹出至PCR管中。按照文本方案中所述处理裂解液后，根据仪器供应商设定的标准流程，将裂解液加入qPCR工作流程中。通过调控分级HFC中注射液体的比例，可调节与细胞表面接触区域的大小。

选择流速时，确保化学效应而非剪切力成为细胞裂解的主要机制。这一点通过使用计算流体动力学确定剪切力得到了验证。图中显示的是利用MFP通过扫描轨迹编程生成细胞岛阵列。

通过调节注射液体比例来调控印迹尺寸，可控制细胞去除的分辨率。该方法可用于多种细胞群体的顺序共培养，从而生成复杂的细胞间相互作用模式。使用氢氧化钠作为处理液体，可使裂解物适用于基于PCR的细胞分析。

在此，采用所述方法对五个和一个足迹的DNA含量进行了定量。一旦掌握，该技术可在30分钟内完成对细胞的处理。在进行此操作时，需注意确保通道和毛细管中无气泡，因为气泡可能对HFC产生不利影响。

请注意，氢氧化钠是一种腐蚀性化学溶液，操作时可能极为危险，因此在进行该实验步骤时，必须采取安全眼镜和实验服等防护措施。通过该步骤，我们可利用微流控探针介导的裂解技术对细胞进行局部分析，例如通过免疫染色或DNA-RNA测序，以回答更多科学问题，如细胞在几何限域条件下哪些蛋白质会过表达。该技术的建立将为分子生物学领域的研究人员探索组织生成与退变过程中的细胞内及细胞外信号传递提供新的途径。

观看本视频后，您应能够充分理解如何在微流体平台（MFP）中通过减法方式对细胞单层进行图案化，以实现局部处理，并构建具有复杂几何形状的细胞共培养体系。