一种简单高效检测人中性粒细胞核因子活化状态的流式细胞术方法

本实验采用流式细胞术检测并定量来自中性粒细胞的分离核及免疫标记核中的核蛋白，以从人外周血中纯化中性粒细胞。首先使用葡聚糖去除红细胞，随后对血浆进行密度梯度离心。然后利用抗受体抗体，通过整合素或Fc受体刺激纯化的中性粒细胞。

接下来分离细胞核，并使用针对目标NU核因子的特异性抗体对样本进行固定，以进行免疫标记。例如，通过流式细胞术最终分析细胞核，以检测核因子活化过程中的微小变化。实验结果表明，通过整合素刺激中性粒细胞可导致转录因子N of kappa B的核内浓度升高。通常，研究核因子活化的信号通路可采用报告基因检测或电泳迁移率变动分析法（EMSA）在原代细胞中进行。

这些方法通常并不适用。流式细胞术可对分离的细胞核中的核蛋白进行快速检测和定量。从健康成年志愿者中采集 10 毫升新鲜血液开始实验。

用移液器将2毫升6%的糊精T 500溶液加入一个15毫升的圆锥形离心管中。然后加入10毫升血液，通过倒置混匀管壁2至3次，随后在一支新的15毫升圆锥形离心管中静置45分钟，使红细胞依靠重力自然沉降。放置5毫升FI小瓶包装。

收集在已沉降的红细胞上方形成的富含白细胞的血浆。小心地将其分层加到菲亚尔包装（fial pack）顶部，形成两相，于4°C下以516 ×g离心20分钟。弃去上清液，并通过轻敲试管管壁使细胞沉淀重悬。

然后将细胞重悬于10毫升冷PBS中。将细胞悬液转移至50毫升锥形离心管中，在4°C下以290 ×g离心5分钟。同前法打散细胞沉淀，并加入10毫升冷低渗溶液以裂解红细胞。

轻轻旋转离心管，精确混匀一分钟。接着，加入10毫升冷的高渗溶液混合物，并置于冰上保存。现在，通过离心沉淀中性粒细胞后，对细胞进行计数。

将中性粒细胞（PMN）重悬于每毫升含10⁷个细胞的溶液中。用预冷的PBS缓冲液将细胞置于冰上保存。取100 µL PMN悬液分装至1.5 mL离心管中。

然后加入终浓度为每毫升10微克的相应单克隆抗体，冰上孵育15分钟。洗涤细胞时，加入一毫升预冷的PBS，离心后吸除上清液。随后轻轻吹打重悬细胞沉淀，并用PBS再洗涤两次。

为了去除未结合的抗体，将洗涤后的PMN重悬于含有60微克/毫升羊抗小鼠IgG的相同初始体积的预温PBS中，根据所关注的核因子，于37摄氏度孵育1至20分钟。现在加入1毫升冷PBS，通过离心沉淀细胞后，弃去上清液，并立即在干冰-乙醇浴中冷冻细胞沉淀。对于每个样本，将试管从干冰-乙醇浴中取出，擦拭干净并重新悬浮。

将冻存的中性粒细胞沉淀重悬于100微升冷的低渗溶液中。将所有样品置于冰上，以监测细胞核完整性。用台盼蓝对细胞核悬液进行染色。

如果细胞核悬液中含有大量完整细胞或碎片，最好弃去该样品，换用另一个样本重新开始实验。通过离心沉淀细胞核后，小心移除上清液，然后加入100 µL冰冷的4%多聚甲醛溶液固定细胞核，并将细胞核置于冰上孵育。再次小心离心沉淀细胞核，弃去上清液后加入100 µL冰冷的透化缓冲液，将样品置于冰上孵育10分钟。

然后通过离心收集通透化的细胞核。此时，细胞核沉淀在离心管底部附着不牢。建议再次进行离心。

如果沉淀物松动，为阻断非特异性结合位点，我们将细胞核重悬于500微升冰冷的含4%胎牛血清（FBS）的PBS中，冰上孵育20分钟。离心收集细胞核沉淀，随后将细胞核重悬于100微升冰冷的PBS（含4% FBS及每毫升2.5微克的针对目标核因子的单克隆抗体）中。样本在冰上孵育20分钟后，用500微升冰冷的含4% FBS的PBS洗涤两次；再将细胞核重悬于100微升冰冷的PBS（含4% FBS及每毫升10微克的相应荧光标记的二抗）中，冰上孵育20分钟。经过两次洗涤后，将细胞核重悬于400微升冰冷的含4%多聚甲醛的PBS中。

使用流式细胞仪（如 Fact Scan 或类似设备）分析免疫标记的细胞核。将采集参数设置为：FSC 对数尺度下设为 10 的负一次方，SSC 对数尺度下设为 196，并在散点图中圈选细胞核群体。每份样本采集 10,000 个细胞核。

然后通过设置为对数尺度、400 倍放大的 FL1 通道分析 fitsy 染料染色细胞核的荧光。该 PMN 纯化方法通常可获得纯度超过 95% 的未刺激中性粒细胞；PMN 细胞核可被高效分离，分离后的细胞核在流式细胞仪的点图上易于识别为与完整 PMN 不同的细胞群。通过交联 β1 整合素，NF-κB 转位至细胞核，细胞核内 NF-κB 的增加表现为荧光信号增强。

类似地，通过交联β2整合素刺激PMN也可诱导NF-κB活化，表现为荧光强度增加。该方法具有较高的灵敏度，能够检测到核因子水平的微小变化，例如，与结合其他细胞表面黏附分子的β2整合素相比，结合细胞外基质蛋白（如纤连蛋白）的β1整合素可诱导更强的NF-κB活化。该方法具有很高的灵活性，可使用多种不同的荧光染料，并允许制备来自不同类型细胞的细胞核，因此可采用这种简单且经济的方法，用于研究多种细胞类型中涉及核内蛋白水平变化的信号转导过程。