一种基于流式细胞术的整合素抑制药物高通量筛选技术

我们的研究聚焦于中性粒细胞整合素。在本研究中，我们旨在建立一种方法，用于筛选β2整合素活化的小分子拮抗剂。我们相信，利用该方法可以发现新的拮抗剂，这不仅有助于加深对整合素生理功能的理解，还可为基于整合素的抗炎治疗提供转化医学层面的见解。

未来，我们将致力于发现新的抗炎药物并解析其作用机制。使用血清移液管，将4毫升肝素化人血小心地叠加在含有8毫升密度梯度介质的15毫升离心管中。在20摄氏度下，以550 ×g离心30至50分钟。

然后使用1 mL移液器移除含有血浆和单个核细胞的上层液体。从下层浑浊条带及其下方约3至4 mL处收集中性粒细胞，转入含有10 mL PBS的15 mL离心管中。轻轻倒置混匀管体2至3次，以混匀中性粒细胞悬液。

将中性粒细胞悬液在 20 摄氏度下以 400 ×g 离心 10 分钟。然后小心弃去管中的上清液，并将沉淀重悬于 5 毫升 PBS 中。再次在 20 摄氏度下以 300 ×g 离心 10 分钟。

去除上清液后，使用真空抽吸法清除管壁及管口周围的残留上清液。将沉淀物重悬于1毫升中性粒细胞培养基中。在1.5毫升离心管中，将1毫升浓度为1.2微克/毫升的抗体溶液与0.2毫升中性粒细胞培养基混合。

向384孔板的阴性对照孔中加入25微升抗体溶液。在15毫升离心管中，将9毫升抗体溶液、21.6微升FMLP溶液和1.7784毫升中性粒细胞培养基混合。向384孔板的阳性对照孔和检测孔中各加入25微升该混合液。

使用多通道移液器，从化合物文库板中转移5 µL化合物溶液至384孔板中。将悬液在500 ×g下离心1分钟。使用16通道移液器，向每孔加入20 µL中性粒细胞悬液。

将培养板置于摇床上，300 RPM 振荡孵育 10 分钟。然后，为固定细胞，向每孔加入 3 µL 16% 多聚甲醛，并在冰上孵育 10 分钟。开启流式细胞仪后，将含有化合物处理的中性粒细胞悬液的 384 孔板放入样品架中。

打开软件。启动新实验。选择384孔板并选择所需的荧光染料。

然后点击“板设置”，拖动以选择所有孔，并点击“样本”。打开高通量开关，在速率面板中选择“高”。在体积框中输入 50。

选择奇数列中的样本，并打开振荡开关。最后，在右侧面板中为样本命名。所测试化合物的平均荧光强度值均高于 cutoff 线，表明这些化合物中未发现β2整合素拮抗剂。