一种定量衰老癌细胞的灵敏方法

本实验的总体目标是以快速且灵敏的方法定量细胞衰老。本文将展示该方法在筛选潜在化疗药物中的应用。首先诱导细胞衰老。

将化疗药物阿霉素加入癌细胞中。接着加入Bain A以中和细胞溶酶体的酸性pH。然后在细胞摄取后加入可穿透细胞的β-半乳糖苷底物C12 FDG。

C 12 FDG 被水解并发出荧光。由于衰老细胞的溶酶体中富含 β-半乳糖苷酶（beta-GCSEs），这些细胞的荧光强度高于非衰老细胞。为了量化荧光差异，对细胞进行流式细胞仪分析，对所得数据的分析可定量不同处理条件下衰老癌细胞的百分比。

与现有的β-半乳糖苷酶方法相比，该技术的主要优势在于能够快速且灵敏地定量衰老细胞。事实上，我们在使用常用的β-半乳糖苷酶检测方法对衰老细胞进行定量遇到困难时，首次提出了该方法的设计思路。尽管我们目前使用该技术检测癌细胞中的衰老状态，但它同样适用于正常细胞。

该方法有助于回答癌症研究领域中的一些快速问题，例如化疗药物是否诱导癌细胞发生 sse，这可能会促进恶性肿瘤的发展。因此，该技术最终可能有助于提示新的癌症治疗方法。在化学通风橱中操作，将 C 12 FDG 粉末溶于 DMSO 中，配制成终浓度为 20 毫摩尔的溶液，分装至 0.5 毫升离心管中，于 -80 摄氏度保存。

DMSO 应在适当的安全部件下使用，同时将 CIN A 一粉末溶于 DMSO 中，配制成终浓度为 0.1 毫摩尔的溶液。将溶液分装至 0.5 毫升微量离心管中，并于 -20 摄氏度保存。

注意，使用CIN时应采取适当的安全预防措施。该实验步骤可使用贴壁或非贴壁细胞进行。此处以人骨髓瘤细胞系RPMI 8 2 2 6为例进行演示。

这些细胞在悬浮状态下生长，实验前24小时，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，使用含有10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素的RPMI 8226培养基培养细胞，并将细胞接种于6孔板中，使其处于细胞增殖曲线的对数生长期。实验时为测定衰老细胞百分比，需准备三种细胞样本：未处理且未进行ST染色的细胞、未处理但用C12 FDG染色的细胞，以及经处理并用C12 FDG染色的细胞。

每种条件下，进行流式细胞术检测癌细胞诱导衰老时，至少需要 5 × 10⁵ 个细胞。通过添加化疗药物阿霉素（doxorubicin），药物浓度和处理时间应根据细胞类型进行调整。本方案已用于 rpmi 8226 细胞的测试。

可通过将每毫升六个细胞的十分之一以15纳摩尔的多柔比星处理48小时来诱导细胞衰老。请勿忘记设置未处理样本作为阴性对照，在37摄氏度及5%二氧化碳条件下孵育。化疗药物处理可能导致细胞凋亡。

因此，两天后，使用台盼蓝排斥法结合血细胞计数板、细胞计数仪和显微镜检测细胞活力。如果活力百分比低于70%，则使用适当的试剂盒（例如Miltenyi的死细胞去除试剂盒）去除死细胞，以确保死细胞不会对后续分析造成偏差。否则，以300 ×g离心5分钟，去除培养基。

然后，在去除上清液后，加入预热的新鲜培养基，其中含有100 nmol/L的氯喹或巴佛洛霉素A一，以中和溶酶体的酸性pH，37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育一小时。将β-半乳糖苷酶底物C12FDG溶解于预热的新鲜培养基中，终浓度为2毫摩尔。在与巴佛洛霉素孵育后进行后续操作。

将 C 12 FDG 直接加入细胞和培养基中，终浓度为 33 µM，在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育两小时。孵育结束后，在 4 °C 条件下以 300 × g 离心五分钟。

离心后，用 PBS 重悬细胞，按前述方法离心，每次洗涤均去除上清液，共洗涤两次。将细胞沉淀重悬于 500 µL 冷 PBS 中，然后进行共免疫标记，以进一步表征衰老细胞群体。如果您没有流式细胞术相关经验，该实验中最困难的部分将是流式细胞术的分析操作。

为确保实验成功，务必设置适当的对照，并根据需要向有经验的人员寻求帮助。在运行第一个样本之前，准备一个双参数图，显示前向散射通道（FSC）相对于侧向散射通道（SSC）。然后运行含有未标记细胞的第一个样本。

设置光电倍增管（PMTs）并定义一个感兴趣区域，排除在样品制备过程中可能出现的死细胞和细胞碎片。该感兴趣区域在单参数直方图中显示，其中横轴以对数形式表示C12 FDG的荧光信号（FL1），纵轴表示事件数量。总事件数代表被分析的细胞数量。

将PMT设置为使未标记的细胞在x轴对数刻度的第一级上显示。如有必要，可通过流式检测未标记细胞来确定细胞的自发荧光。在流式细胞仪上检测第二个样本（含未经处理的细胞），在显示FL1的一维直方图上，将光标置于微弱标记细胞群之后。

该阈值可用于区分未衰老细胞（标记较弱）与衰老细胞（标记较强）。运行含有经处理细胞的第三个样本，标记较强的衰老细胞将出现在上一步确定的阈值之上。

如有需要，可通过将明亮事件数除以总事件数来计算衰老细胞的百分比。也可通过平均荧光强度来评估β-半乳糖苷酶活性，以评价化疗处理所诱导的细胞衰老。本实验中，使用多发性骨髓瘤细胞系 RPMI 8226（商品化来源），经阿霉素（一种化疗药物）处理两天后，按照本视频所述方法检测细胞衰老。这些直方图显示了左侧为未处理细胞的荧光信号，右侧为处理后细胞的荧光信号。

一群荧光标记明显的细胞（代表衰老细胞）出现在区域 V。同时，使用 β-半乳糖苷酶染色法对相同的细胞样本进行染色。在此代表性图像中，完全呈蓝色的细胞和部分呈蓝色的细胞被展示出来，以说明准确区分真正呈蓝色的衰老细胞的困难性。为了说明 C12FDG 在测定衰老细胞百分比时的特异性，细胞还接受了不同浓度的多柔比星处理。

通过将明亮事件的数量除以总事件数量，计算出衰老细胞的百分比。在5、25和50纳摩尔阿霉素剂量下，衰老细胞的比例分别为0.8%、15.78%和26.31%。这表明C 12 FTG标记对衰老细胞具有特异性。

观看本视频后，您应充分了解如何通过流式细胞术定量衰老细胞，并掌握后续实验流程，例如通过免疫标记等方法对衰老细胞进行表征。请务必注意，操作DMSO或癌细胞时可能存在极高危险性，因此在进行本实验流程时应始终采取必要的安全防护措施。