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取用化疗药物预处理过的癌细胞,该药物可诱导部分细胞发生衰老。
这些细胞会积累自体荧光的脂褐素颗粒,这是一种已知的衰老标志物。
加入一种可进入细胞并抑制溶酶体质子泵的抗生素,以阻止溶酶体酸化。
pH 升高会使溶酶体酶失活。
衰老细胞在接近中性的pH条件下仍会过表达溶酶体β-半乳糖苷酶,因此该酶可作为细胞衰老的生物标志物。
加入β-半乳糖苷酶底物。孵育。
β-半乳糖苷酶将内化的底物水解为荧光产物,从而标记衰老细胞。
离心并弃去上清液。
加入细胞活力染料。在活细胞内,活性酯酶将染料转化为不可透过细胞膜的荧光产物。而细胞膜完整性受损的死细胞则保持未染色状态。
通过流式细胞术检测表达脂褐素和荧光β-半乳糖苷酶底物双标记的活细胞,以识别衰老细胞。
定量测定衰老细胞的百分比以证明药物的有效性。
首先,通过向细胞沉淀中加入含1 µM 巴佛洛霉素A的DMEM溶液,调节培养细胞样品的溶酶体pH,使细胞浓度达到每毫升1×10⁶个细胞,并用移液器混匀。在37°C下以低速旋转孵育30分钟。随后,为染色衰老相关β-半乳糖苷酶,无需洗涤,直接向样品中加入浓度为10 µg/mL的DDAOG储存溶液。
置于旋转仪上避光孵育60分钟。同前,离心试管。弃上清液,用1毫升冰上预冷的含0.5% BSA的PBS洗涤沉淀。然后,向洗涤后的细胞沉淀中加入300 µL稀释的calcine violet 450 AM溶液。冰上避光孵育15分钟。
将细胞样品转移至适用于流式细胞仪的试管中。在数据采集软件中,打开一个紫色通道直方图以及一个远红通道对绿色通道的点图。以低进样速度启动细胞仪数据采集,并将用DDAOG染色的阳性对照样品置于进样口。开始采集样品数据。调节各通道电压,使每个图中超过90%的事件均位于图示范围内。
当所有参数设置优化后,每份样本记录 10,000 个事件。将仅含载体并用 DDAOG 染色的对照样本置于进样口。启动数据采集,每份样本记录 10,000 个事件。观察自发荧光或 AF 以及 DDAO 半乳糖苷信号相对于阳性对照的升高情况。将样本数据以 .FCS 文件格式保存,并将文件导出至配备流式细胞术分析软件的工作站计算机。