一种用于研究蛋白质与DNA相互作用、发现基因表达转录调控因子及鉴定新型抗肿瘤药物的定量检测方法

本实验的总体目标是展示一种定量 DNA 结合分析方法，该方法可用于研究蛋白质与 DNA 的相互作用、发现基因表达的转录调控因子以及鉴定新型抗肿瘤药物。该方法首先通过制备链霉亲和素包被的检测板，并加入适当的生物素标记 DNA 靶标。第二步是加入核提取物蛋白，可选择性地同时加入潜在抑制剂，使其与 DNA 靶标结合。

接下来，使用一抗和辣根过氧化物酶偶联的二抗检测结合的转录因子。最后一步是在孔中加入辣根过氧化物酶底物，以引发显色反应。最终通过分光光度计测量显色程度。

随着时间的推移，颜色变化的程度将反映出 DNA 结合的程度以及潜在 DNA 结合抑制剂的作用效果。该技术相较于其他方法（如电泳迁移率变动分析）的主要优势在于，它是一种定量的 DNA 抑制剂结合检测方法。实验开始时，需为每种测试条件准备足够数量的细胞培养物，每份至少含有三乘以十的七次方个细胞。

此处使用表达 Runx2 蛋白的人骨髓内皮细胞。当细胞融合度达到 80% 时，用 0.2 µg/mL 的诺康唑处理细胞，以在 G2/M 细胞周期边界阻滞细胞生长。

这将稳定运行X二聚体蛋白，并在16小时后产生最大DNA结合。裂解细胞并按照随附文本方案中的指示分离蛋白。蛋白分离后，使用标准BCA法测定蛋白浓度。

然后将样品以每份10微升的体积分装，浓度为每毫升2至5毫克，并于负80摄氏度保存。使用0.1摩尔的碳酸钠溶液固定96孔板，每孔加入300微升该混合液。准备足够的孔数，以确保每个样品均设三个复孔。

将酶标板置于室温下摇床上孵育 2 小时。然后用 300 µL 链霉亲和素洗涤缓冲液洗涤酶标板 3 次，并加入 100 µL 生物素标记的双链寡核苷酸（每孔 1.25 nmol），在摇床上继续孵育 2 小时。随后，用链霉亲和素洗涤缓冲液再洗涤酶标板 3 次。

然后每孔加入100 µL主混合液，其中包含一种XDNA结合缓冲液、DNA结合蛋白（每孔3至9 µg）以及poly DIGC（每孔1 µg）。接着，向相应孔中加入含有潜在抑制剂（如维生素D3）或适当稀释的溶剂对照（如乙醇）的主混合液。随后盖上培养板，置于4°C摇床上过夜，紧随核提取物孵育之后。

用链霉亲和素洗涤缓冲液洗涤平板三次。然后每孔加入90微升工作浓度为0.2纳克/微升的X2特异性单克隆抗体，溶于链霉亲和素洗涤缓冲液中。盖上平板，在室温下于摇床上孵育一小时。

然后用链霉亲和素洗涤缓冲液再次冲洗各孔，并每孔加入90微升二抗混合液，其中含有5纳克/微升的Fab特异性亲和纯化的HRP标记抗体，用链霉亲和素洗涤缓冲液稀释。将二抗在室温下于摇床上孵育30分钟。

然后用 300 微升每孔的 Strp 洗涤缓冲液洗涤六次。接着，从原装瓶中直接向每孔加入 50 微升四乙基联苯胺底物以显色，并对样品进行连续监测。将样品放入分光光度计中，连续测定 635 纳米处的吸光度。

对于单次测量，将样品在室温下避光孵育10至20分钟。在此期间，孔内的颜色应从无色变为不同程度的蓝色。通过向每个孔中加入50微升硫酸终止反应。

然后使用96孔板读数仪在450纳米处测定每个孔的吸光度。此处显示的图表是生物活性维生素D3对Runx2 DNA结合影响的连续监测示例。所测试的浓度对Runx2 DNA结合影响较小。

尽管其他维生素D3化合物已被证明具有显著作用，但本研究中测试的化合物5 2 2 1 9 7 5是通过计算机辅助药物设计鉴定得到的。经测试，该化合物在1纳摩尔至100微摩尔浓度范围内表现出剂量依赖性抑制rux2结合的效果，仅需0.01微摩尔的该化合物即可抑制50%的renx2 DNA结合。

观看本视频后，您应该能够很好地掌握如何进行 DNA 结合实验，并测试潜在的 DNA 结合抑制剂。