同时利用双相机发射分光系统在两个发射通道中捕获实时图像：在细胞黏附研究中的应用

本实验的总体目标是利用双相机发射分光系统，通过平行板流动腔黏附实验同时记录两种颜色的实时图像序列。为此，首先需要对成像装置上的两台相机进行校准。随后，制备细胞和反应性基底，并安装平行板流动腔。

随后，对相机设置进行校准，以实现双色图像采集，并对相机对齐进行任何必要的数字校正。接着采集图像序列，以展示高时间分辨率的双色图像获取过程。与单相机系统相比，双相机发射分光系统的优势在于，可为每台相机设置不同的曝光时间，同时保留完整的视场。

该技术有助于解答细胞黏附领域的关键问题，例如细胞表面黏附分子的定位如何影响细胞迁移、炎症和癌症转移等动态生物学过程。以下实验步骤需要使用倒置落射荧光显微镜，该显微镜应配备高强度光源及导光管、复合滤光立方体，以及双相机分光成像系统。

显微镜装置应连接至一台运行成像软件的计算机，该软件需能够采集并整合由单色CCD相机捕获的图像。此处使用StreamPix 5多相机软件配合SimulPix模块。首先在任务功能区中打开StreamPix 5，选择工作区。

然后在屏幕最右侧打开工作区管理器并选择新建工作区。为相机命名后，根据软件提示从预填充列表中选择与相机型号匹配的采集卡，工作区中将出现一个小相机图标，表示已接收到相机信号。此时，可通过屏幕查看显微镜下成像的物体。

对第二个相机工作区重复此过程，然后对合并的工作区再重复一次，此时所有相机均处于使用状态。将出现错误消息。此消息属于正常现象，表示已将工作区一和工作区二中的已分配相机通过位于查看屏幕右侧的对接面板分配至合并的工作区。

工作区一和工作区二中的图像将作为两个伪彩图像在合并工作区中叠加显示。该操作过程中最困难的部分是相机的对准。为确保成功，我们使用制造商提供的校准玻片，并严格遵循制造商的说明进行操作。

为了校准双相机发射分光系统的相机，请将明场或相差光引导至显微镜目镜。将制造商提供的金属涂层校准网格放置在显微镜载物台上，并使网格在载物台上对齐方正。以无像素合并、无自动缩放的方式显示网格，调至清晰对焦，然后移动但不取下分光镜外壳，以校准相机一。

然后使用海山端口一上的调焦旋钮再次对图像进行对焦。接下来，将二向色镜镜筒完全推入双通道采集装置，使图像被二向色镜分光至两个相机。松开三个5/60英寸的紧定螺钉，旋转CM卡口端口二上的第二个相机，直至两个图像中的网格方向完全一致；再使用C卡口端口二上的调焦旋钮，使第二个相机的图像清晰对焦。

为完成对齐，请使用 DC 二右侧的 RL 旋钮调整组合图像的位置，直至右侧抬升的垂直边界在合并的工作区中精确对齐。然后使用 UD 旋钮调整第二幅图像的上下对齐，直到水平网格条正确对齐为止。

如果在上下对齐过程中发生轻微的相机旋转，请通过松开相机二的3个5/60英寸螺丝并旋转，直到显示的图像正确对齐，以纠正此问题。按照随附文档中的描述，使用抗CD24和TECA-4-5-2抗体，并以LOR-5-68和4-88作为二抗，对BET-20乳腺癌细胞进行染色，以准备用于平行板流动腔黏附实验。染色后，务必制备相应的单色对照，然后将细胞加入平行板流动腔的储液器中。将两段独立的管路分别连接至流动腔的入口和出口端口。

一根管子将连接至含有悬浮在添加0.1%PSA的DPBS中的标记细胞的储液器。将另一根管子连接至注射泵，该泵将以指定流速抽取液体。将真空管线连接至流室，并将流室置于含有表达凝集素或CHO-E细胞单层的35毫米组织培养皿上方。

调整流室和流室垫圈以确保形成良好的真空密封。从储液器中抽出液体，同时观察流室组件是否密封良好。最后，将流室组件放置在显微镜上，打开光源，并通过目视检查完成显微镜的设置。

确保二向色镜 housing 处于正确的压下工作位置，且未处于旁路模式。手动切换至荧光模式，并选择绿色-红色荧光滤光片组，分别确定曝光时间和增益。使用相机一采集红色荧光下的细胞图像，使用相机二采集绿色荧光下的细胞图像。

根据需要手动压下二向色镜以获取图像。接下来，将仅用红色菌群染色的 BT 20 细胞悬液注入与平行板流动室入口端口相连的储液器中，其中含有四种偶联抗体。

使用注射泵将 BT 20 细胞灌注到平行板流动腔内的 choi 单层上。在成像软件的实时设置中，调整相机一的曝光时间以获取红色通道的图像，并将相机二的曝光时间与相机一的曝光时间保持一致。

如果在绿色通道中观察到图像，则存在串色伪影。若发生此情况，保持相机一和相机二的曝光时间一致，并逐步缩短曝光时间，直至绿色通道中不再可见串色伪影。如有必要，调整相机一的增益以改善红色通道中的图像可见度。

接下来，从储液槽中移除残留的 BT 20 细胞悬液，并用 DPBS 替代。使用注射泵将溶液灌注过 choi 单层，直至单层上不再可见 BT 20 细胞。随后用仅标记绿色荧光四偶联抗体的 BT 20 细胞悬液重新填充储液槽。

使用绿色单色控制重复相机校准过程。此次需设置相机二的曝光时间，以在绿色通道中成像细胞，同时避免相机一在红色通道中采集到串色伪影。使用成像软件同时查看从流室中两个单色CCD相机捕获的图像。实验。

使用 Stream Picks 的 Simul Pics 模块合并从两个相机采集的图像。在 Simul Pics 或其他替代软件中使用数字校正调整功能，对合并后的图像进行空间对齐。如有必要，可使用 Simul PIC 模块对图像进行水平、垂直和旋转校正。

该系统现已准备就绪，可用于同时采集双色图像。本视频中所述的双相机发射分光系统通过平行板流动腔黏附实验进行了演示。如图所示，该系统检测到经荧光标记的 BT 20 细胞，其中抗人 CD 24 标记呈红色，HECA 4 52 标记呈绿色，后者可结合与 SCOs 相关的分子。

一些滚动的细胞显示红色信号但无绿色信号，另一些细胞显示绿色信号但无红色信号，还有一些细胞则同时显示红色和绿色信号。在此，相机保持了足够的光学和时间分辨率，能够追踪细胞在反应性基质上沿流动方向滚动时发生的翻滚和翻转过程中的细胞特征。合并的发射通道揭示了CD24和sLeX分子在BT20细胞表面的分布及其共定位情况，这些BT20细胞正在滚动并黏附于CHO细胞单层。

这些图像展示了一个 BT 20 细胞的局部放大，其中 CD 24 和饱和分子共定位，在红色和绿色伪彩发射通道合并后呈现为黄色至橙色的斑点。综上所述，该信息表明，双相机发射分光系统具备所需的空间、时间和光学分辨率，可用于揭示细胞和分子特征，例如在流动腔黏附实验中，当细胞快速通过视野时的应用。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何设置并校准双相机发射分光系统，以实时双色成像平行板流动腔黏附实验。该方法可应用于其他利用荧光技术研究细胞行为的体外实验。