使用荧光显微镜观察线虫中的细菌

本实验的总体目标是观察荧光标记的细菌共生体在其线虫宿主内的分布情况。该目标的实现首先通过接合方式将荧光蛋白标记到细菌上；第二步是通过收集卵来分离AIC线虫。

接下来，将AIC线虫与其荧光标记的共生细菌共同培养，以实现两者的自然结合，最终确定共生细菌在线虫宿主体内的定位情况。通过荧光显微镜可确定线虫群体中发生此类共生关系的频率。该方法有助于回答共生研究领域中的关键问题，例如：细菌在宿主体内的定位于何处？宿主群体中细菌携带情况的分布如何？

细菌菌株过夜培养后，按1比100的接种比例，将供体菌、受体菌和辅助菌分别转接至不含抗生素的营养丰富的培养基中，于各菌株适宜的温度下培养，直至菌液达到对数生长中期。随后，将上述菌液混合于同一微量离心管中，于17,900 ×g条件下离心2分钟，弃去上清液，并将菌体沉淀重悬于30 µL新鲜培养基中。接着，将菌液悬液点样至无抗生素的营养丰富的平板培养基上，待悬液完全干燥后进行后续操作。

将平板倒置，在对受体细菌最适且在适用情况下对供体和辅助细菌也允许的温度下过夜培养。然后，刮取菌斑并在选择性抗生素平板上划线以获得单菌落，从而得到纯培养的细菌划线，用于分离单个菌落。最后，确保所获得的菌落为受体共生菌，而非供体菌株。

通过筛选受体特异性表型的存在。例如，可通过过氧化氢酶试验将锡诺阿比德氏菌（cino abdi bacteria）与大肠杆菌（e coli）区分开，并通过在对应于荧光质粒蛋白的波长下观察荧光来确认质粒的存在。将天然细菌共生体培养过夜后，取600微升菌液均匀涂布于8至10个直径为10毫米的脂质琼脂平板上，随后将平板置于25摄氏度、避光且无湿气的环境中孵育。

两天后，向细菌菌苔中加入500微升含有5,000条感染性幼虫线虫的培养基。将培养板在25摄氏度下继续孵育三天后，取20微升水滴加到显微镜载玻片上。然后用无菌接种棒从细菌菌苔上刮取少量线虫。

将线虫棒放入水中，使线虫游离出来。在低倍镜下观察此玻片。若可见卵和雌虫，当雌虫体内含有卵时，继续操作：在培养皿表面加入几毫升水，轻轻晃动培养皿，然后将水倒入50毫升锥形管中。

线虫应从培养皿上脱落，且不再在培养皿表面可见。让线虫沉降到管底，然后用移液管吸去管顶部的过量水分，并用干净的水重新填充管子。待成年线虫沉降后，再次用移液管吸去多余水分，随后用卵液填充锥形管。

然后在室温下轻轻倒置混匀各管，精确混匀10分钟。振荡后立即以1,250 ×g在室温下离心锥形管，离心时间精确为10分钟，并开启刹车。随后迅速倒掉上清液，用卵溶液通过移液吹打重悬沉淀，并用新鲜的卵溶液补满锥形管。

通过倒置离心管三到五次充分混匀卵悬浮液，然后立即离心收集卵并倾去上清液，操作方法如前所示。使用移液器将沉淀重悬于misogyny、肉汤或LB培养基中，随后将卵悬浮液转移至15毫升锥形管中。现在用LB培养基加满15毫升管，采用与之前相同的快速步骤技术在肉汤中洗涤卵三次，最后将重悬的P线虫卵稀释至每微升至少含有10个卵。

将卵转移至含有5毫升LB培养基和抗定植细菌抗生素的六厘米培养皿中。该培养皿在经过过夜培养并筛选出荧光细菌后，可用perfil包裹保存最多四天。使用无菌接种棒将600微升细菌培养物涂布于10毫米脂质小孔板上，并在25摄氏度下培养。

两天后，将500至5,000个线虫卵接种到每个脂质平板上。如果平板 previously prepared bacterial lawns。然后将线虫与细菌的共培养物在25摄氏度、避光且无湿气的条件下培养，直至感染性幼虫在平板边缘形成一圈模糊的白色环状物。

当观察到感染性幼虫后，取下脂质琼脂平板的盖子，将该平板底部放入一个空的 100 毫米 × 20 毫米培养皿的底部中。然后向该培养皿中加入足够的水，使水位达到较小平板高度的一半左右，随后继续培养，直至子代感染性幼虫进入水中为止。

从水中或从合适细菌菌苔上收集目标生活阶段的线虫后，将少量ole颗粒溶于30微升水中，每50微升线虫样品加入一到两微升该麻痹剂。然后取约20至30微升已麻痹的线虫样品转移到显微镜载玻片上，并在样品上加盖盖玻片。使用光学显微镜观察线虫，确保线虫位于视野范围内。

为了确定细菌的定位，需在荧光显微镜下对线虫进行拍照，同时结合明场显微镜成像，然后将两幅图像叠加。可能需要尝试多种放大倍数和线虫的不同视野，以找到细菌的位置。

从两种培养基中分别收集线虫群体，并对其细菌共生体的定植情况进行计数和评分。为了获得可靠的统计结果，每个样本最好至少计数100条线虫，且每个类别中至少有30条线虫，如表中所示。这些线虫在脂质琼脂上培养时的定植率约为14.6%，在肝脏、肾脏琼脂上培养时则为68.6%。

其他线虫和细菌物种已被证明具有不同的定植水平。该示意图展示了斯泰纳线虫（Steiner NEMA）雌虫的一般形态。插图显示了20倍放大下S fot graphic雌虫的微分干涉相差图像。

插图中的黑箭头指示外阴，而白箭头指示可见的卵。该图像显示了一个发育完全但尚未孵化的伏特线虫卵，放大倍数为40倍；从伏特线虫中分离出的这些卵在10倍放大倍数下成像。此处第一张图像展示了与泽诺阿普图斯菌相关的施泰纳线虫的代表性显微图像。

Alvin 的线虫与其表达 GFP 的细菌共生体相关联，从而生成了这幅复合图像。该图像是将相差图像与荧光图像叠加而成。箭头指示的是存在于感染性幼虫线虫体内的细菌。

此图像显示了一条表达 GFP 的 X nla 细菌感染的 S carpa capsi 幼虫线虫。该图像的构建方式与前一幅图像类似，展示了幼虫线虫肠道腔内分布的绿色荧光蛋白标记细菌，表现为遍布线虫肠道腔的绿色杆状结构。除了上述描述的实验步骤外，还可结合其他方法，例如在线虫宿主与共生细菌建立关联之前对细菌进行遗传操作，以回答更多科学问题，例如：宿主与微生物关联所必需的分子机制是什么？