利用可生物降解的聚合物纳米颗粒编程干细胞以实现治疗性血管生成

本实验的总体目标是利用海洋动物后肢缺血模型，展示聚合物纳米颗粒在干细胞中过表达治疗性基因的应用。该过程首先通过两步微波反应合成可生物降解的聚合物，随后制备携带治疗性基因的聚合物纳米颗粒；第二步是在体外转染人脂肪来源的干细胞，使其过表达血管内皮生长因子。

接下来，将编程后的干细胞经肌肉注射到缺血的后肢，以促进治疗因子的产生。最后一步是利用生物发光成像和激光多普勒成像，随时间监测缺血肢体中细胞的存活情况和血液再灌注。最终，可通过定量基因表达分析和组织学检测，评估治疗因子的局部表达以及组织再生的效果。

与传统的血管生成方法相比，该技术的优势在于利用干细胞作为药物递送的载体。这一策略使我们能够利用干细胞向缺血部位迁移的天然趋向能力，同时还能对微环境信号产生动态响应。用于质粒DNA递送的纳米颗粒具有高效性和可生物降解性，可显著降低细胞毒性，并实现更多拷贝的DNA在细胞内递送。

该技术可应用于多种具有临床相关性的细胞治疗，因为它利用一种可生物降解的非病毒载体将基因导入自体细胞。在通风橱中操作，称取丁二醛（DLI）并将其转移至含有搅拌子的玻璃吸入瓶中。接着，将预热的五氨基一戊醇加入同一瓶中。立即将该瓶置于搅拌器上，并将转速设为600 RPM。

将小瓶转移至设定为90摄氏度的烘箱中，4小时后将搅拌速度提高至1000转/分钟，随后将速度降低至300转/分钟，继续搅拌12至16小时。准备就绪后，在含有搅拌子的玻璃小瓶中，向5克C 32中加入10毫升无水四氢呋喃。用铝箔包裹后，在另一含有搅拌子的玻璃小瓶中剧烈涡旋至完全溶解，然后加入10毫摩尔的四乙二醇二胺。

向该小瓶中加入 40 毫升四氢呋喃，将两个小瓶均置于搅拌器上搅拌五分钟，然后将它们混合。用铝箔覆盖反应产物，并在室温下静置 24 小时。最终产物称为 C 32 1 22。

接下来，将30毫升无水二甲醚分别转移至五个50毫升的离心管中。在向无水二甲醚中加入C 32 1 22后，会形成白色浑浊溶液，涡旋混匀管内溶液，然后进行离心。提取的聚合物将沉积于管底，弃去上清液，并重复此步骤两次。

提取后，将打开的试管放入干燥器中抽真空过夜，并确保试管避光保存。次日，称量含有 C 32 1 22 的试管以确定最终质量。最后将提取的聚合物溶解于无水 DMSO 中，浓度为 100 毫克每毫升。

用于纳米颗粒的制备。首先，在另一支离心管中将质粒DNA用醋酸钠稀释至终浓度为120微克/毫升；同时将C 32 1 22用醋酸钠稀释至终浓度为3.6毫克/毫升。随后，将两支离心管中的溶液转移至一个15毫升Falcon离心管中，并立即在高速下涡旋振荡10秒。

将离心管置于室温下静置10分钟，以使纳米颗粒形成。在纳米颗粒形成的同时，将先前接种的组织培养瓶中的培养基更换为7.8毫升完全添加的DMEM培养基。

将纳米颗粒溶液转移至组织培养瓶中，均匀铺开后放入培养箱。两小时后，用DMEM培养基替换含纳米颗粒的培养基。四小时后，细胞即可用于体内注射。

当转染的细胞准备就绪后，用PBS将细胞重悬并计数，调整细胞密度为每毫升6×10⁶个细胞，以确保每只小鼠接受相同数量的细胞。将细胞悬液分装至微量离心管中，每管体积为110 µL。接着，对先前已建立后肢缺血模型的小鼠进行麻醉。

通过脚趾夹捏确认麻醉效果后，使用27号注射器清洁注射部位。重悬细胞并吸取100 µL悬浮液。将一半细胞悬浮液注射至内收肌区域，随后将另一半注射至小腿肌区域。

注射后，将注射器留置原位至少15至30秒，以防止药液渗漏。注射完成后，保持动物体温直至其完全恢复。进行生物发光成像时，通过脚趾夹捏确认麻醉效果，然后按前述方法清洁注射部位。

用胰岛素注射器吸取100微升Lucifer，进行腹腔内注射。在将动物放入ivis Luciferase成像室之前，以一分钟的曝光时间对小鼠进行成像。图像获取后，标记感兴趣区域。

在此情况下，对细胞注射部位的缺血肢体持续每三到五分钟测量一次荧光素酶信号，直至信号达到峰值并开始下降。该数值用于在不同小鼠之间以及不同时间点进行比较。实验完成后，将小鼠从成像舱中取出，并保持动物体温直至完全恢复。在选定的时间点收取组织样本。

安乐死后，在腹下部远端至后肢近端处环形切开后肢周围的皮肤。将皮肤向后剥离后，在骨盆与股骨关节之间截除后肢。最后，分离内收肌和腓肠肌。

为进一步分析，这些图像展示了 C 32 1 22 的合成过程。在此过程中，通过含有 DAL 端基的单体与含有伯胺端基的单体之间的迈克尔加成反应，生成了与 ACR 相关的终止型 C 32 AC。在此示例中，通过添加胺端基单体，可形成改性的 PBAE 聚合物，以提高转染效率。

成功的转染可通过此处所示的绿色荧光蛋白过表达来判断。该生物发光成像数据显示了小鼠在第0天和第14天的情况。在将表达GFP荧光素酶的脂肪源性干细胞注射至后肢后，具有代表性的多普勒图像显示，在第0天，对侧后肢出现缺血诱导，随后实现成功的血液再灌注。

注射过表达VEGF的脂肪源性干细胞后14天。R-T-P-C-R证实，在细胞注射后第4天，治疗组中编码治疗性蛋白的vgf成功上调，而PBS对照组中未检测到表达。此外，还可采用其他结合干细胞与基因递送的方法，以鉴定促进组织再生的新型治疗靶点。

观看本视频后，您应能充分理解如何合成用于非病毒基因治疗的可生物降解聚合物，并利用这些聚合物对干细胞进行编程，以治疗缺血性疾病。在体内利用非病毒工程化干细胞原位过表达治疗因子，可能对多种退行性疾病的治疗具有广泛的应用价值。