一种用于量化iPSC来源内皮祖细胞成血管潜能的体外三维模型及计算分析流程

本方案能够提供对血管发生过程中分子水平和组织整体水平机制的独特见解，有助于在建模中为心血管疾病治疗工程化功能性血管系统。该方案可用于构建稳定的三维血管网络，以评估不同平台的血管生成潜能，同时还提供了一条免费、开源的计算分析流程，用于分析最终的网络拓扑结构。首先，在37摄氏度条件下，向D5D6分化细胞培养板的每孔中加入250 µL细胞解离液，孵育10分钟。

孵育结束后，使用 P1000 移液器吸头将细胞解离为单细胞悬液。将细胞悬液汇集至一个 15 毫升的锥形离心管中进行离心。我们将沉淀重悬于 200 微升预冷的分选缓冲液中，并加入 5 微升浓缩的荧光标记 CD34 抗体，在 4 摄氏度下避光孵育 10 分钟。

孵育结束后，用五毫升冰上预冷的分选缓冲液洗涤细胞。将细胞悬液通过40微米孔径的滤网过滤至五毫升荧光激活细胞分选（FACS）管中。在上机检测前，先在流式细胞仪上对一份10⁴个未标记细胞进行分选，在高荧光强度区域设定门控，该区域不应包含任何未标记细胞，以此作为阴性对照。

然后根据CD34高表达，对含有由诱导性多能干细胞衍生的内皮祖细胞的标记样本进行分选。分选结束后，将内皮祖细胞转移至微量离心管中进行离心。对于祖细胞的胶原水凝胶包封，我们将分选后的细胞沉淀重悬于200 µL内皮细胞生长培养基2中，并添加10 µL的ROCK抑制剂Y-27632。

将细胞加入预冷的1.8毫升微量离心管中，管内含400微升接种培养基，置于冰上。向细胞悬液中加入350微升胶原蛋白，混匀。溶液将变为淡黄色。

接下来，将10微升1-Muller氢氧化钠加入胶原蛋白和细胞溶液中。溶液将变为亮粉色。取56微升中和后的胶原蛋白细胞溶液，分别加入96孔超低吸附U型底细胞培养板的各个孔中，在37摄氏度下孵育30分钟。

孵育结束时，在明场显微镜下观察各孔，检查细胞是否均匀分布。然后向每孔加入 100 微升新鲜配制的内皮细胞生长培养基 2（补充 ROCK 抑制剂和血管内皮生长因子），并将培养板放回 37°C 培养箱中。培养一周后，向每个水凝胶对应的 48 孔板中的一孔加入 250 微升 4% 多聚甲醛，并移除水凝胶中的培养基。

然后使用尖头镊子将水凝胶转移至含有甲醛的孔中。室温下孵育10分钟后，迅速用PBS洗涤水凝胶，并加入250微升浓度为0.5%的非离子型表面活性剂，在室温下对三维培养物进行5分钟的通透处理。用250微升PBS在室温下洗涤两次，每次5分钟，每次洗涤液中添加300毫升甘氨酸，随后将每个水凝胶浸入250微升封闭缓冲液中，在室温下封闭30分钟。

将细胞与用封闭缓冲液稀释的适当一抗在4摄氏度下孵育过夜，随后用0.5%乳化剂和Dulbecco's PBS洗涤两次。第二次洗涤后，在避光条件下于室温下用相应种属特异性的二抗孵育细胞两小时，然后按照示例用0.5%乳化剂和Dulbecco's PBS将3D培养物洗涤两次。为观察细胞核，将DAPI用PBS按1:10000比例稀释后加入样品中，室温孵育两分钟，随后用0.5%乳化剂和Dulbecco's PBS洗涤两次。

然后使用尖头镊子将每个样本转移至合适的观察容器中。在完成分化、分选并包埋于胶原水凝胶后，细胞通常会保持圆形约24小时，随后开始迁移并形成初始管腔。培养约6天后，在明场显微镜下观察水凝胶时，可观察到原始毛细血管网络。

在共聚焦显微镜上对固定并染色的、含有细胞的水凝胶进行成像后，将预处理的图像转化为骨架结构，从而实现对网络总体长度和连通性的分析。在FACS操作后必须添加抗生素，因为该仪器内部难以彻底灭菌，且应在细胞包封后24小时去除抗生素。利用该技术，我们能够确定哪些模拟细胞外基质的生物材料的物理和化学特性调控了由iPSC衍生的内皮前体细胞的血管生成潜能。