多深度圆形截面血管内皮化微通道芯片的制备方法

本实验的总体目标是在芯片上构建一种具有多深度圆形横截面的内皮细胞活性微通道，以模拟体内微血管的三维结构，并在受控的连续灌注流动条件下运行。该目标通过以下步骤实现：首先采用光刻技术，利用正性可回流光刻胶，制备具有半圆形横截面微通道网络的母模；第二步是利用该母模复制出两条聚二甲基硅氧烷微通道，将其对齐并键合，从而形成圆柱形微通道网络。

接下来，在可控的连续培养基灌注条件下，将原代人脐静脉内皮细胞接种于微通道网络内，并培养四天至两周。最终，在微通道网络的内表面形成一层融合的细胞单层，通过显微镜下观察膜结构和细胞核的排列可确认其形成。该结构可用于功能性微血管的计算，为研究复杂的血管现象提供平台。然而，传统的单个微血管检测方法，如血管细胞迁移实验、血管形成实验以及环状微血管收缩实验，在模拟微血管的三维几何结构和连续流动控制方面存在局限性。

我们技术的主要优势，即现有的微加工方法，是能够常规地制备出具有多深度的微流控通道网络，该网络可模拟体内具有圆形横截面的微血管的复杂三维几何结构。该方法还允许设计微血管生物磁系统，使其近似遵循更缓慢的流动规律，并维持流体在所需的水平，从而使整个通道的阻力较低，且流体损失在整个网络中更加均匀。演示该操作流程的将是我实验室的一名研究生。该流程首先制备光刻胶主模具，该模具包含直径在30微米至60微米之间的微通道，具体步骤详见文本方案：简而言之，在使用前24小时，将光刻胶从4摄氏度的冰箱中转移至洁净室，并使其升温至室温。

首先，按照文本方案中的步骤，将正性回流光刻胶旋涂在预先清洗过的硅基底上。然后，通过带有图案的掩膜对光刻胶进行紫外光曝光，再显影形成图案化的微通道。最后，经过回流处理，形成具有半圆形截面的微通道网络。

一旦主模具准备就绪，按10:1的重量比配制聚二甲基硅氧烷（PDMS）溶液（基础剂与固化剂），并使用行星式离心混合器充分混合。将PDMS溶液浇注到回流后的光刻胶主模具上。将浇注好的PDMS置于真空干燥器中15分钟以脱气。

如有必要，使用氮气去除残留气泡。将PDMS置于60摄氏度的烘箱中烘烤3小时，使其固化。随后将固化的PDMS层从母模上取下。

使用锋利的打孔器在通道网络中打孔，以形成进样口和出样口。用氮气清洁PDMS表面。将两层PDMS置于等离子清洗仪中，在45 milato的操作压力和3.5立方英尺/分钟的氧气流速条件下，进行30秒的氧气等离子体处理。

然后在光学显微镜下手动对齐PDMS表面。如有必要，可使用一滴水以更好地控制对齐。最后，将装置置于60摄氏度的烘箱中加热30分钟，以实现永久性键合培养。

在添加了L-谷氨酰胺并补充有10%胎牛血清的培养基中培养原代人脐静脉内皮细胞或VE。将装置置于45毫托的工作压力和3.5立方英尺/分钟的氧气流速下，用氧气等离子体处理5分钟。然后用去离子水加载该装置，并在层流生物安全柜中用紫外光照射8小时以进行灭菌。

在细胞准备好的前一天，用一倍磷酸盐缓冲液（PBS）清洗装置，然后用纤维连接蛋白包被。在4摄氏度下于冰箱中孵育过夜。当细胞达到融合状态后，首先用Hanks平衡盐溶液冲洗细胞，随后加入胰蛋白酶，用胰蛋白酶-EDTA处理细胞以收获细胞。

将细胞在37摄氏度下孵育2至6分钟。胰蛋白酶消化完成后，用胰蛋白酶中和液中和胰蛋白酶EDTA。计数细胞，然后在重悬前进行离心。

使用含8%葡聚糖的培养基悬浮细胞，葡聚糖用于增加培养基黏度，有助于细胞在FI enc ENC涂层后更好地沉降和贴附。用一份XPBS洗涤装置，然后加入培养基，并在37°C下孵育15分钟。随后，将浓度为每毫升300万至400万个细胞、悬浮于含8%葡聚糖培养基中的细胞加入装置中。

在装置的一个入口处放置 20 微升细胞液滴，并倾斜装置以将细胞引入微流控通道。15 至 20 分钟后，细胞将开始附着在通道侧壁上。每 15 分钟旋转一次装置，以获得更均匀的细胞分布。

如有必要，可进行额外的加样。经过五到六小时的静态培养后，贴壁细胞将开始充分铺展。使用远程控制的注射泵系统建立长期灌注，保持每小时10微升的稳定流速；灌注流速可调至更高，并可持续四天至两周不等。

当细胞在装置内达到汇合状态时，首先用一倍体积的磷酸盐缓冲液（XPBS）洗涤装置，以彻底去除培养基。随后，在室温下避光孵育五分钟，向装置中加入稀释的红色染料。最后用培养基洗涤，以终止染色过程。

长时间孵育染料可能导致细胞毒性及脱附。随后将用1×PBS稀释的蓝色染料加入装置中，室温避光孵育5分钟，再用1×PBS彻底清洗装置。在倒置光学显微镜下观察细胞染色情况。

如果染色效果良好，用固定液填充微通道，然后将整个装置浸入固定液中，并用铝箔完全包裹。将装置置于4°C的冰箱中保存，以防止装置干燥和荧光褪色。固定后的装置现已准备好进行共聚焦成像，可使用激光扫描共聚焦显微镜、扫描电子显微镜和光学显微镜进行观察。这些方法被用于表征回流前后光刻胶的再流动情况以及复制的PDMS通道的形貌。

PDMS微通道网络的几何特征已在此表征并展示。PDMS模具的圆形横截面显示了每个分支层级的通道尺寸。结果表明，利用光刻胶回流技术可通过更为便捷的方法制备具有多深度分支结构的通道网络，并可用于设计近似遵循穆雷定律的微血管仿生系统，此处展示的是使用红色荧光细胞膜染料和蓝色细胞核染料获得的显微图像。

圆形横截面视图显示，血管内皮细胞（VE）排列在圆柱形微通道网络不同分支区域的内表面。由于体内微血管结构复杂，对这些微小血管进行实时监测十分困难。本研究开发的基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的芯片具有良好的光学特性，可实现高质量的实时成像，从而清晰观察内皮细胞在环形通道网络中的排列情况，如本共聚焦显微影像所示。

观看本视频后，您应充分了解如何为此质量模式制备回流装置，创建具有圆形横截面的PDMS微通道网络，将内皮细胞载入装置，并建立长期的培养基灌注。总之，芯片上开发的内皮细胞串联微通道提供了一种快速且可重复的方法，用于构建具有多种深度的圆形横截面微通道网络，该结构可模拟体内微血管的几何形态。

本实验方案展示了先进微加工与微流控技术中的独特功能，可用于构建具有长期连续灌注控制能力的微血管模型，同时实现高质量的实时成像。随着微流控通道在细胞生物学、组织工程及生物工程应用中的日益广泛，该技术展现出重要价值。芯片上的内皮化微通道是微血管研究中一种潜在的有效方法。