FtsZ 聚合实验：简易方案与注意事项

以下实验的总体目标是利用简单的检测方法和设备，确定研究 FTSZ 聚合及其活性的适宜条件。通过在不同条件下进行 FDSC 聚合物沉降检测，寻找 FDSZ 发生聚合的合适条件。作为第二步，我们开展光散射检测，以实时研究 FDSZ 的聚合过程。

接下来，我们进行GTP水解实验，以确定FTSC的聚合相关性GTP酶活性。通过离心沉淀、光散射和GTP水解实验获得的结果，可显示基于特定细菌来源的FTSC研究最适合的实验条件。本文展示的技术可在任何实验室中简便操作，能够快速评估特定FTAZ的聚合能力。我们发现，在存在其他蛋白质的情况下操作FTAZ时，选择合适的缓冲体系尤为关键。演示该技术的是我实验室的研究生EVA crawl。

首先，在选定的聚合缓冲液中加入5 µL 100 mM氯化镁以及12 µM的细菌蛋白FDSC和/或SEP F，该缓冲液具有不同pH值和组分，具体如配套文本方案所述。接着，将试管放入带有摇动功能的培养箱中，在30°C、300 RPM条件下孵育2分钟。待试管内溶液充分混合后，通过加入1 µL的GTP或GDP混合物（来自100 mM储存液）启动聚合反应，使终浓度为2 mM。

然后将样品重新放回摇床培养箱中，继续孵育 20 分钟。接下来，使用 TLA 55 转子或等效设备，在室温下以 20,000 RPM（若使用其他转子，则为 24,600 G）离心 15 分钟。离心结束后，将上清液转移至洁净的离心管中，并将沉淀物保留以备后续使用。

取20微升已转移的上清液，与20微升两倍浓度的上样缓冲液在另一管中混合。盖紧管盖，将样品在98摄氏度下煮沸10分钟。接着，向之前保留的每个沉淀组分中加入50微升两倍浓度的上样缓冲液，并通过在98摄氏度下煮沸10分钟使聚合物悬浮。

样品煮沸结束后，向含有沉淀的离心管中再加入 50 微升去离子水。随后，将每个样品的上清液和沉淀物各取 10 微升，并排加样至 10% SDS-PAGE 凝胶上，以 150 伏电压电泳。电泳完成后，取出凝胶并用考马斯亮蓝 G-250 染色。

然后按照随附的文字实验方案，使用流式细胞仪对凝胶进行成像并定量蛋白质。首先打开荧光分光光度计，让光源预热数分钟，以避免热波动。同时打开循环水浴，并将水温设定为30°C，以保持样品室温度恒定。

随着系统升温，设定光谱仪的工作参数。将检测器高压设为300伏，发射和激发波长设为350纳米，狭缝宽度为4纳米。然后通过选择基于时间的采集模式，设置持续时间为3,600秒的数据采集程序。

将一支体积为 200 微升、光程为 1 厘米的荧光比色皿小心地放入水浴中的清洗液中，超声处理 5 分钟以彻底清洁。接着，根据随附文本方案中所述的九种聚合缓冲液，每种缓冲液各准备 294 微升的主混合液，每种主混合液的终浓度分别为 10 毫摩尔氯化镁和 12 微摩尔 FDSE（按 300 微升总体积计算）。然后短暂涡旋混匀各混合液，将第一种聚合缓冲液中的 196 微升转移至比色皿中。

将样品放入光谱仪中，在30摄氏度下孵育两分钟，使样品温度升至30°C。两分钟后开始采集数据，并等待90秒以确认信号稳定。然后加入4 µL的100 mM GTP或GDP。

混合样品后继续采集数据整整一小时。对所列的每种缓冲液重复上述步骤。在选定的聚合缓冲液中配制1.5毫升浓度为2毫摩尔的GTP。

同时在相同缓冲液中配制浓度范围为0至40微摩尔的磷酸盐标准品稀释液。接下来，按照生化检测试剂盒说明书配制孔雀石绿工作试剂。然后配制四种总反应体积均为360微升的主混合液：主混合液一含有来源于枯草芽孢杆菌（B. subtilis）的FDSZ，主混合液二含有来源于大肠杆菌（E. coli）的FDSE。

第三和第四种预混液用作对照，其中含有EDTA而非氯化镁。接下来，将预混液和磷酸盐标准品各取20 µL，加入A-Q-P-C-R 96孔板中，每种预混液和磷酸盐标准品各占16个孔，排列方式如图所示。

用移液器将180微升的2毫摩尔GTP储备液加入到板的最后一列孔中。然后将板放入PCR仪中，运行一个单循环程序，设置为30°C持续40分钟。

在另一块96孔板中，用移液器向A1至H10孔中加入20微升孔雀绿工作试剂。然后向实验组A1至H8孔中加入60微升聚合缓冲液，接着向每列各孔中加入20微升2毫摩尔的GTP溶液。按照此处所示的预定时间间隔，于不同时间点检测反应情况。

30分钟后，从第一块板的第一泳道开始，上下吹打混匀各混合物；将20微升从第一块板的第一泳道转移至第二块板的第一泳道，并上下吹打混匀。此为孔雀石绿显色反应30分钟时间点的起始点。30分30秒时，将20微升从第一块板的第二泳道转移至第二块板的第二泳道并混匀。此为孔雀石绿显色反应20分钟时间点的起始点。

在33分半时，向第一块板的第8孔加入20微升GTP，混匀，随后以32秒的间隔依次对第3至第7孔重复上述步骤。然后将20微升转移至第二块板的第8孔并混匀。此步骤代表反应时间为零，是孔雀绿显色反应的起始时间点。

34 分钟后，从第一个板的第 9 排中取 80 微升含有磷酸盐标准品的溶液加入第二个板的第 9 排中，并在 34.5 分钟后混匀；接着，从第一个板的第 10 排中取第二个磷酸盐标准品 80 微升转移至第二个板的第 10 排并混匀。然后去除样品中所有气泡，在室温下继续孵育 25.5 分钟。孵育结束后。

从实验开始60分钟时，将培养板放入96孔板读数仪中。每30秒在630纳米处测定一次，持续5分钟，共获取10个时间点的数据。第一次测定对应第一道，第二次对应第二道，以此类推，确保每道的孔雀绿显色时间完全相同。

接下来，利用磷酸盐标准曲线计算每个样品中的游离磷酸盐，并将数据绘制成随时间变化的磷酸盐释放量曲线。然后根据曲线的线性范围计算F-D-S-Z-G-T-P的水解活性。此处显示的是各样品沉淀物中SEP F和FDSZ的百分比。

只有当样品中同时存在 SEP F 和 GTP 时，FDSZ 才能在沉淀中被检测到且高于背景水平。这些微管中 SEPPE 与 FDSZ 的确切化学计量比尚不清楚，但这些结果表明，SEPPE 的含量多于 FDSZ。此处展示了枯草芽孢杆菌（B. subtilis）和大肠杆菌（e. coli）FDSZ 的光散射结果，其在含有 2 毫摩尔 GTP 的 50 毫摩尔氯化钾缓冲液中组装而成。

F-D-S-E-B-S 产生的光散射信号比 FDSC EC 高 20 至 40 倍，具体倍数取决于缓冲液的 pH 值。有趣的是，增加缓冲液中氯化钾的浓度对 F-D-S-Z-E-C 的光散射信号没有显著影响，但在 300 毫摩尔氯化钾条件下，F-T-S-Z-B-S 在 pH 7.5 时信号降低了约 80 倍，在 pH 6.8 时降低了 30 倍，在 pH 6.5 时降低了 45 倍，相较于含 50 毫摩尔氯化钾的缓冲液。FDSZ 的 GTP 水解活性在不同缓冲条件下使用游离磷酸的比色法进行测定。

在不同 pH 条件下，FT SZ 的 GTPS 活性均随氯化钾浓度的增加而升高。在 50 毫摩尔氯化钾条件下，由于 F-D-S-Z-B-S 丝状体发生束化，导致 gtpa 活性降低。FDSZ EEC 在氯化钾存在时的 GTPS 活性比 F-D-S-Z-B-S 高出 3 至 6 倍，原因是 FDSC EEC 聚合物解聚速度更快。

最后，在300毫摩尔氯化钾条件下，F-D-S-Z-B-S与F-D-S-Z-E-C之间的GTP水解活性差异减小，这可能是由于F-D-S-Z-B-S丝状结构的束集程度降低所致。完成此步骤后，可进行其他金属元素的电镜显微分析，以进一步探究样品中fts多聚体结构的相关问题。