系统分析 体外 使用多孔板微流控系统进行细胞滚动实验

以下实验的总体目标是在严格控制且具有生理相关性的剪切流条件下，进行通量更高的细胞滚动研究。该目标通过使用一种多孔微流控系统实现，该系统中特殊培养板的相邻孔通过微流控通道相连。系统的接口将电控气动泵连接至多孔板的顶部，并施加气动压力，从而以设定的流速驱动液体从孔内经微流控通道流动。

在微流控通道被目标底物或单层细胞包被后，将待研究的细胞引入微流控通道，以探究其与包被表面之间特定的滚动相互作用；随后可在不同实验条件下，利用适当的软件分析细胞与底物或单层细胞包被表面相互作用时的滚动特性。与现有的平行板流动腔等方法相比，该技术的主要优势在于，能够在精确控制、生理相关的管状流动条件下，以显著更高的通量研究细胞滚动特性，同时最大限度地减少试剂和细胞的消耗。该平台有望通过快速、准确地分析旨在影响细胞滚动与归巢能力的工程化策略，推动外源性细胞治疗技术的发展。

为了在微流控通道内包被蛋白底物，首先将25至50微升新鲜配制的蛋白溶液加入入口。然后施加2 dyne/cm²的剪切力，持续5分钟，使溶液灌注进入通道。当出口处出现液滴时，停止流动，将含有目标蛋白的溶液在适当条件下孵育一定时间，随后从每个孔中吸除溶液。

接下来，向出口孔中加入 200 至 500 微升 PBS，然后以每平方厘米两达因的剪切流处理五分钟，以清洗通道，从而在微流控通道内形成单层细胞。首先，将目标细胞从培养皿中轻轻胰酶消化 3 分钟，加入两倍体积的完全培养基终止反应，随后在室温下以 400 ×g 离心 5 分钟。接着，用 10 毫升完全培养基重悬细胞沉淀进行洗涤。

然后将细胞重悬于1毫升新鲜的完全培养基中，计数后调整细胞悬液至适当浓度，随后将25至50微升细胞悬液加入每个入口。现在将培养板置于显微镜载物台上，施加2达因/平方厘米的剪切流，使细胞流入微通道，直至观察到细胞充满整个通道。停止流动后，向出口和内陆孔中各加入200微升适当的细胞培养基，然后在37°C、5%CO2条件下静置，使细胞沉降并贴壁。

三小时后，用完全培养基清洗微通道，以去除未贴壁的细胞。此时细胞应已完全汇合，可用于诱导微通道内内皮细胞的炎症活化。向入口孔中加入100微升新鲜配制的TNF-α溶液，然后施加2 dynes/cm²的剪切流5分钟，将溶液引入微通道中。

对于对照组非活化内皮细胞通道，在入口处加入 100 微升内皮细胞基础培养基。为阻断内皮细胞表面的 P 选择素或 E 选择素，向通道中加入每毫升 5 微克的相应中和抗体，并将培养板在 37 摄氏度孵育 1 小时。随后用基础培养基洗涤通道，再开始滚动实验。

在显微镜下仔细检查通道，确认通道已正确包被。然后用基础培养基将HL 60细胞悬液洗涤两次，在第二次洗涤后进行细胞计数，随后将细胞重悬于IMDM中，浓度为每毫升5 × 10⁶个细胞。将25至50微升细胞悬液加入出口孔后，将培养板置于37°C温控载板架上，并将载板架放置于显微镜载物台上。

将细胞引入微流控通道中。应在10至15秒内观察到细胞从出口流向入口。此处可观察到荧光标记的HL 60细胞与表达P选择素的表面相互作用，表现出滚动反应。为研究滚动反应与剪切应力的关系，先将剪切应力降低至0.25 dynes/cm²，在每个目标剪切应力条件下，使用视频采集功能获取20至32秒的视频，并逐步将剪切应力从0.25 dynes/cm²增加至5 dynes/cm²。

最后，使用CCD相机以每秒11帧的流式采集模式获取实验视频。例如，此处显示的是一个HL 60细胞在chope细胞单层上滚动的过程。使用适当的兼容软件分析细胞滚动的轨迹和速度。

HL 60 细胞被认为是滚动行为的金标准，因为它们表达多种归巢配体，包括滚动配体 P 选择素和糖蛋白配体 1 以及 CI Lewis X。为了测试多孔板微流控系统的性能，多个微流控通道被同时涂覆不同的底物，并分析 HL 60 细胞在这些底物上的滚动相互作用。结果显示，细胞在 P 选择素编码的表面表现出强烈的滚动行为，细胞首先从流动中被捕获，随后表现出明显的滚动运动。如本图所示，并与文献报道一致，HL 60 细胞在 E 选择素和 P 选择素表面表现出相似的滚动行为，但在 Fibronectin 涂覆的底物上则无此现象。

通过兼容软件分析的细胞速度与剪切应力作图，显示细胞在P选择素和E选择素上的滚动反应显著，平均速度介于每秒1至12微米之间。为评估该微流控系统在高效检测目标细胞与表面包被的细胞单层之间相互作用的可行性，本研究使用了如图所示的CHO P细胞——这些细胞经转染后可稳定表达P选择素，但不表达E选择素。HL-60细胞在CHO P细胞单层上表现出显著的滚动反应，以验证HL-60细胞的滚动运动是否确实由P选择素介导。

在将HL 60细胞灌注到通道之前，单层细胞预先与针对P选择素或E选择素的阻断抗体进行孵育。如本图所示，用P选择素抗体阻断CHO-p单层细胞后，HL 60细胞在表面滚动的数量显著减少，表明P选择素确实介导了HL 60细胞的滚动。如前所述，多孔微流控板包含多个独立的微流控通道，可实现对多种不同条件的高通量测试。

这种有利的设计被用于在微流控通道内接种内皮细胞，以便在多种实验条件下快速分析HL 60细胞与内皮细胞之间的相互作用。为了模拟炎症条件，内皮细胞预先用促炎性细胞因子TNF alpha处理，导致内皮细胞表面E选择素表达上调，而P选择素则无变化。有趣的是，HL 60细胞不与未活化的内皮细胞发生相互作用，在该表面未观察到细胞滚动现象。相反，HL 60细胞在TNF alpha活化的内皮细胞上表现出显著的滚动行为，平均速度为每秒5至15微米，以探究P选择素或E选择素在HL 60细胞与活化内皮细胞滚动相互作用中的参与情况。

TNFα 激活的内皮细胞预先与P选择素或E选择素阻断抗体共同孵育，随后分析HL-60细胞的滚动情况。如图所示，在TNFα激活的内皮细胞上阻断选择素导致在活化内皮单层上滚动的细胞数量显著减少。相比之下，使用同型对照抗体或针对在活化内皮细胞上不表达的果胶的抗体，对HL-60细胞在活化内皮层上的滚动无显著影响。这些数据表明S选择素直接参与了HL-60细胞在TNFα激活的内皮细胞上的滚动，与先前报道结果一致。

分析软件可追踪单个细胞与表面相互作用时的运动路径。因此，本研究专门追踪了单个细胞与经TNFα激活的内皮细胞相互作用时的路径，这些内皮细胞分别处于未阻断、e选择素抗体阻断或未阻断的状态。如图所示，在未阻断的激活内皮细胞上滚动的细胞数量显著高于在e选择素抗体阻断的激活内皮细胞上滚动的细胞数量。此外，HL-60细胞在未阻断内皮细胞上的滚动运动呈现出连续且有力的特征，而在e选择素抗体阻断的内皮细胞上的细胞滚动路径则呈现片段化。

与此发现一致，HL 60 细胞在未阻断的 TNFα 激活的内皮细胞上滚动速度显著低于在 E-选择素阻断的内皮细胞上的滚动速度。本研究展示了利用多通道微流控系统高效开展细胞滚动实验的方法，可在严格控制的管流条件下实现每小时多达 10 个滚动实验的通量。总体而言，该微流控系统成为研究细胞滚动（细胞归巢的关键环节）的一种强大技术。

例如，我们实验室目前正在利用该系统筛选可增强间充质干细胞归巢能力的条件，以此作为提高其治疗效果的策略。