利用高通量微流控装置产生动态环境条件

微环境具有高度复杂性和动态性，其细胞因子、配体的浓度和组成持续变化。为体外研究干细胞分化、免疫应答以及器官芯片平台上的器官发育等复杂生命机制，构建类似的培养环境至关重要。然而，利用移液等传统生物医学方法，难以实现纳升级体积、毫秒级精度的化学信号生成与递送。

为了应对这些挑战，亟需一种能够交替进行图像采集并产生动态组合与顺序信号输入的培养平台。本方案介绍了微流控装置的设计与制备流程。所提出的微流控芯片包含1500个培养单元、增强型蠕动泵阵列以及现场混合模块。

我们证明该平台适用于单细胞、二维细胞群体以及三维神经球的研究。芯片上复杂且动态的环境条件对神经干细胞的分化和自我更新具有重要影响。其设计与制备过程的详细步骤如下。

使用 AutoCAD 软件进行芯片设计。为了适配显微镜载物台的尺寸，该微流控芯片大小约为七乘五厘米，包含 1,500 个培养腔室。其中一个重要的特征是集成了蠕动泵，该蠕动泵由八条流道和宽度为 200 微米的控制通道组成。

与Stephen Quake在2002年提出的蠕动泵相比，控制通道与流体通道之间的重叠区域增加了约16倍，每次泵送循环可输送约15纳升液体，足以在芯片上并行维持1,500个独立的环境条件。该装置的另一个重要组成部分是双层培养室，可维持无剪切力的培养环境。通过将流体快速引导至顶层，可避免产生不必要的剪切应力。

细胞、组织以及关键的条件培养基保留在底部，保持不变。数值模拟表明，当液体从左至右流经培养室时，可有效避免剪切力的产生。

即使在每秒10毫米的输入流速下，细胞或微米级组织仍能保持在培养单元底部不受干扰。我们采用紫外光刻技术制备了用于复制成型的硅晶片。使用SU-8 3025负性光刻胶，制备出高度为25微米、宽度为100微米的微流体通道。

使用 SU-8 3075 光刻胶制备高度为 75 微米和 150 微米的培养腔室。采用 AZ50X 正性光刻胶制作圆形孔结构，该结构与控制通道重叠，以确保良好的连接。为制备微流控芯片，首先对图案化硅片和空白硅片进行 TMCS 处理。

将不同量的PDMS按单体与催化剂10:1的比例充分混合，并在真空腔室中于-0.85兆帕条件下脱泡一至两小时。通过以2,200转/分钟的转速旋涂PDMS获得控制层。随后将硅片转移至培养箱中，在80摄氏度下孵育60分钟。

使用定制的光学装置和等离子体刻蚀机将不同的层对齐并键合在一起。在80摄氏度下再进行两小时热键合后，打孔形成入口孔。将芯片键合到PDMS涂层的盖玻片上，该盖玻片尺寸与96孔板相同，并在80摄氏度下固化至少12小时后方可使用。

操作时，控制通道通过塑料管连接至微型气动电磁阀。所有气动孔的开关均由定制的MATLAB程序通过图形用户界面进行控制。每个芯片的顶压式PDMS膜阀的最佳关闭压力需单独确定，通常在25至30 PSI之间。

通过使所有系列的孔位动态地产生组合和顺序输入，可在芯片上生成相应的反应环境。细胞在达到80%融合度时收集，并用DMEM培养基重悬，细胞密度约为每毫升10的6次方，随后通过加压将含细胞的溶液加载至芯片中。对于贴壁培养和悬浮培养的神经干细胞，均收集细胞后直接将细胞球加载至芯片中。

进行图像采集时，使用配备自动平移载物台和数字互补金属氧化物半导体相机的倒置显微镜。通过软件控制载物台和图像采集，选择左上角和右下角的腔室作为定位点，并按顺序移动平移载物台至各点，使用4x物镜获取初步图像。随后将4x物镜更换为20x物镜，并调整成像参数，包括光照强度、曝光时间等。

然后定位选择点，使每个腔室的位置形成13×15的腔室矩阵，或由程序自动定义。确定腔室坐标后，平移台将移动至各个腔室，并对X、Y、Z焦平面进行精细调节。设置成像周期的时间间隔和持续时间。

保存路径，然后开始成像。该系统可用于多种目标动态追踪，例如明场下的神经干细胞分化，以及神经干细胞成球过程的荧光场成像。数据分析。

使用自定义的 MATLAB 程序将 nd2 格式转换为 Tif 格式，并根据时间点对数据进行分割。选择待分析的对象是细胞还是组织。

输入用于分析的阈值、目标大小和噪声大小。或者，您可以选择逐步分析以优化参数，然后对所有数据进行分析。

将结果保存为 MAT 格式后，使用绘图功能绘制结果或轨迹。本文描述了基于光刻技术的高通量微流控芯片系统用于活细胞微环境动态控制的制备与培养方案。我们还介绍了一些需要严格控制的参数，例如 PDMS 膜阀的闭合压力以及腔室并行流体的旋转控制。

在传统的细胞体外培养中，细胞培养环境的处理需手动操作，耗时且费力，液体添加难以实现标准化控制，尤其是溶液的微量添加。此外，还存在加样误差、药物浓度不均以及试剂消耗量大等问题。

然而，利用我们的微流控系统，可以以固定剂量、相同流体体积和均匀浓度作为刺激器重复施加刺激，同时在不同的培养腔室中比较不同的培养条件。通过调节流体，可实现与某些微型化时间分辨率回刺激不同的、并进一步细分分辨率的刺激模式。此外，我们的系统通过简单的操作即可获得大量具有可比性的实验结果。

我们的系统基于扩散原理，对细胞微环境产生的机械干扰极小。为了获得更稳定的细胞微环境芯片，可以增加缓冲层的厚度或降低培养层的深度，或者减少培养基更换时的进液流量，即降低压力，这将有利于细胞行为的研究。需要注意的是，本研究仅考察了3T3细胞和NSC细胞的培养。

对于其他细胞或细胞系，应采用与我们的参数相类似的培养条件进行调整。