淋巴结内注射可生物降解聚合物颗粒

本实验的总体目标是利用直接注射技术将生物材料疫苗颗粒递送至淋巴结。首先，采用双重乳化法合成脂质稳定化的聚合物颗粒；然后洗涤颗粒，并测定其材料特性，如粒径、载药量或稳定性。

接下来，在小鼠尾根部注射示踪染料，以便在染料引流至淋巴结后进行观察。最后一步是识别被 D 标记的淋巴结，并在此位置注射少量聚合物颗粒。可采用组织学、免疫荧光和共聚焦显微镜技术来确认颗粒在腹股沟淋巴结中的存在及分布情况。

将淋巴结直接注射与用于疫苗接种的生物材料相结合，能够精确控制淋巴结微环境中疫苗组分的种类和剂量，并实现这些组织中 cargo 的可控释放。所有疫苗都必须到达淋巴结才能发挥效力，因此明确生物材料及所载免疫信号如何影响局部淋巴结内的信号传导，对于将这些局部事件与全身免疫应答关联起来至关重要。

这一知识将有助于我们更深入地理解生物材料疫苗通过传统途径给药时的作用机制。尽管生物材料的淋巴结内递送可作为研究其对淋巴结结构影响的工具，但该平台也为开发针对癌症和自身免疫性疾病的新型治疗性疫苗与免疫疗法提供了实际应用的机会。对于微粒，需在冰上以12瓦功率对含有聚合物、脂质及其他水不溶性载荷的有机相进行超声处理。

为制备水相与油相乳液，加入500微升蒸馏水（H2O），或含有1毫克肽蛋白或其他水溶性组分的水溶液。持续搅拌30秒。轻轻上下左右摇动离心管，围绕涡旋仪尖端旋转，以确保充分乳化。

现在，将水油乳液倒入40毫升H2O中，在16,000 RPM下均质3分钟，制备水包油乳液。接着，加入磁力搅拌子，搅拌水包油乳液过夜，以除去多余的溶剂。溶剂去除过夜后，将乳液通过40微米尼龙网细胞筛过滤至50毫升锥形离心管中，离心5分钟，倾去上清液，将颗粒沉淀物重悬于1毫升水中，并将悬浮的颗粒转移至1.5毫升微量离心管中。

通过5分钟离心收集颗粒。采用激光衍射或光散射法测定颗粒大小。确保加入分馏池的水体积达到足以进行校准和空白校正的水平。用移液器将10微升颗粒悬液加入分馏池中。

关闭粒径分析仪样品室门，然后测量PLGA的粒径，折射率设置为1.60。

在注射前一天，使用软件界面基于数量基础计算颗粒直径。根据经动物护理与使用委员会（IACUC）批准的动物实验方案对小鼠进行麻醉。通过脚趾反射评估麻醉深度。

通过夹捏反射测试并监测呼吸，确保呼吸频率为每分钟100至120次。剃除尾巴根部及后肢部位的毛发。清除动物腹侧的毛发，并沿后肢关节上方 lateral 延伸至背侧区域的毛发。

每次染料注射时，使用微量移液器将10微升染料溶液转移至微型离心管中，并用31号针头将全部10微升溶液吸入1毫升胰岛素注射器中。随后在尾根部两侧皮下各注射10微升染料溶液，两次注射之间进行染料负荷。涂抹温和的脱毛膏以去除残留的毛发。

务必涂抹后肢与腹部之间的区域。三分钟后，用戴着手套的手蘸取温水，轻轻将脱毛膏揉入皮肤。立即重复操作，以去除多余的脱毛膏。

接下来，用温水浸湿一块软布或纸巾，单向擦拭小鼠的下半部分。将小鼠置于加热灯下使其恢复，然后继续固定至少12小时。检查麻醉后的小鼠，确认示踪剂或染料已流入每个腹股沟淋巴结。

淋巴结应可见为靠近后肢大腿和腹部区域的一个深色斑点。现在，将颗粒重悬于蒸馏水中，配制成每种注射所需的浓度。使用微量移液器将10 µL的颗粒溶液转移至微量离心管中。

将全部10微升液体吸入连接在1毫升注射器上的31号胰岛素针头中。用针头以与皮肤呈90度角的方向绷紧染色淋巴结周围的皮肤。刺入皮肤至1毫米深度。

缓慢注射全部体积，同时监测可见的淋巴结是否肿大。将小鼠置于加热灯下恢复，然后送回饲养环境或进行其他检测。首先，确认颗粒的合成情况及粒径分布。

乳液溶剂蒸发合成方案可通过目视检查最终乳液进行定性评估。乳液应为均匀的悬浮液，无可见聚集体。颗粒粒径分布可通过激光衍射或动态光散射确认，颗粒样品应呈现单峰分布。

通过修改实验方案，加入一种或多种荧光货物分子（如荧光肽或疏水性染料），可进一步对颗粒合成进行定性评估。染料可用于定位淋巴结并指导颗粒注射。在训练过程中，可在注射染料后处死小鼠并进行解剖，以熟悉淋巴结的解剖位置。通过共聚焦显微镜观察切片并染色的淋巴结，可确认颗粒在感染淋巴结的T细胞区和B细胞区内的分布情况。

通过荧光显微镜注射并成像后，可在淋巴结中观察到颗粒特性（如大小）的差异。掌握该技术后，整个实验可在两天内完成：第一天进行颗粒合成和动物准备；第二天进行颗粒洗涤、表征及淋巴结内注射。

观看本视频后，您应能充分理解如何利用示踪剂或染料对小鼠的腹股沟淋巴结进行可视化并实现注射。该技术可将生物材料疫苗载体非手术直接递送至淋巴结，实现以往无法达到的精准控制水平。生物材料的直接淋巴结递送将使科学家、工程师以及免疫学和疫苗研发人员能够深入探究生物材料疫苗与免疫信号和淋巴结之间的基本相互作用，从而揭示这些材料刺激和调控免疫应答的机制。