一种基于网状模具的无支架三维心脏组织构建方法

本方案描述了一种基于新型简易模具的三维心肌组织构建方法，该方法利用球形细胞聚集体作为无支架心肌组织构建的工具。在我们的实验中，分离并使用了三种细胞：人诱导多能干细胞来源的心肌细胞、人心脏成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞，以制备单细胞悬液。细胞组成为70%心肌细胞、15%成纤维细胞和15%内皮细胞，置于50 mL锥形管中。

随后，我们将细胞悬液分配至超低吸附悬滴系统的每个孔中，三天后可自发形成数百个跳动的球状体。然后收集这些球状体，并将其植入一种新型模具腔内。将组织置于含培养基的无菌容器中，在培养箱内的摇床上维持数天。

随后移除模具，得到具有机械完整性的无支架组织片。悬滴装置是一种可重复使用的超低吸附孔板，含有850个微孔，每个微孔直径为350微米。该悬滴装置与标准六孔板兼容。

制备细胞悬液后，将含有一千万个细胞的四毫升细胞悬液分别加入悬滴系统的每个孔中。将装置置于37°C、5%二氧化碳和95%湿度条件下培养。72小时后，可观察到自发形成搏动的球状体，其平均直径为350微米。

通过将悬滴装置放入另一含有培养基的培养皿中，轻轻旋转以释放类球体，使其从悬滴系统底部的孔隙中漂出，从而收获类球体。这是用于三维、无支架心脏组织构建的新型模具的示意图。该装置包括操作垫、填充底座和新型模具。

该新型模具由一个底座、一个底部方形板、一个底部网片、10层由精细不锈钢齿状结构制成的侧网、一个顶部网片、一个顶部方形板、固定管和止动销组成。该新型模具系统可制备不同尺寸的组织，包括2×2毫米、4×4毫米以及6×6毫米。

使用角柱将底部基底方板和底网堆叠并对齐。然后借助一对无菌镊子，将10层侧网以交替方向堆叠，形成由细小不锈钢针状突起构成的网状结构。接着用1倍磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗填充基底，以降低表面张力，便于将类球体植入新型模具中。

在相同的甲烷中润湿新型模具型腔后，将球状体置入预设的所需尺寸的型腔中。放置后，过量的培养基通过网状模具排出，使球状体充满并形成预定义型腔的形状。然后将顶部网片和顶方板组装到角柱、止动销上，并固定夹持管，以防止球状体被冲出。

将填充好的新型模具系统转移至六孔板中，加入6毫米的B-27添加培养基，然后置于摇床上的培养箱中，在30至40 RPM条件下培养7至10天。培养时间可根据心肌补片的大小进行调整。培养结束后取出系统，移除固定管、塞子、顶部方形板和顶部网筛。

然后逐一小心地滑出分层的侧网，注意不要破坏组织。在移除所有侧网后，可在底部网的上方获得一个完整的心肌补片。24小时内可观察到功能性同步搏动。

这种基于新型模具的方法是一种高效且简便的三维无支架心脏组织构建技术，所需人工操作极少。所获得的多层组织由融合的球状体构成，具有良好的结构完整性和同步搏动行为。该基于模具的创新方法为现有工程化组织的生物制造技术提供了一种成本低、可扩展的替代方案。