通过荧光法检测神经元组织中一种持续性DNA病毒的基因组和转录本 原位 杂交结合免疫染色

本实验的总体目标是通过荧光原位杂交技术，检测潜伏感染小鼠三叉神经节切片中单纯疱疹病毒一型的基因组。首先将病毒接种至动物唇部，随后经过28天的孵育期，使病毒在三叉神经节中建立潜伏感染。接着，采集三叉神经节组织，进行包埋并冷冻切片。

组织切片需经过一系列预处理步骤，包括在柠檬酸钠缓冲液中加热的关键步骤。最后，使用特异性针对疱疹病毒的荧光探针进行荧光原位杂交。最终，通过共聚焦显微镜可观察到病毒基因组在单个感染神经元细胞核内的定位情况。

在许多情况下，研究各种生命周期需要使用动物模型。本技术的主要优势在于，它采用机构内流式细胞术方法，能够在单细胞水平上提供数据。HSV感染的皇家杀伤模型可重现人类HSV-1感染自然史的大部分特征。

这是该病毒的天然宿主。初次感染发生在口腔组织，随后病毒从嘴唇传播至三叉神经节。三叉神经节是人类 HSV 潜伏感染的主要部位。结合免疫染色和染色技术。

该方法有助于回答有关疱疹病毒潜伏感染的关键问题，例如病毒如何与细胞核组分相互作用，以及这些相互作用将如何影响潜伏状态的维持及病毒最终的再激活。首先，准备一只已麻醉的小鼠和一份HSV-1病毒储备液，用不含酚红的培养基重悬。

使用双目立体显微镜，将针头插入左侧上唇黏膜与皮肤交界处的上皮下层。在五秒内注入 0.5 微升病毒溶液，然后在同一位置进行第二次病毒注射。将小鼠转移至 37 摄氏度的培养箱或加热垫，直至其苏醒。

然后将其放回饲养笼中，按照文本方案规定的恢复时间进行恢复，再进行灌注固定。在下颌两侧分别剪开。接着在门齿后方剪除鼻尖部分，以暴露鼻腔。

用剪刀将腭部剪成两半，然后将其移至一旁。三叉神经节位于腭部下方，呈白色长椭圆形，长约两到三毫米，并与三叉神经相连。

切断两侧三叉神经节的神经分支，使其从脑干释放。使用手术钳取出神经节，并将其转移至含20%蔗糖的PBS溶液中，于室温孵育24小时。次日在室温下将两个三叉神经节共同包埋于一个冷冻切片块中。

将包埋介质在负80摄氏度下冷冻，直至在恒冷箱切片机上进行切片。将三叉神经节纵向切成10微米厚的切片，并收集到预热至30摄氏度的超粘附载玻片上。每张载玻片可容纳4至5个切片。

为切片添加多个系列标签可能非常有用。如果计划进行多项后续应用，则在将切片于-80摄氏度保存前，让其干燥5至10分钟。在本方案中，探针的制备是通过使用SI 3D CTP对含有HSV-1基因组30千碱基片段的cosmid进行NIC转录标记来完成的。

沉淀物悬浮于去离子甲酰胺中，由于第一天掺入了S SI三价态，应呈现粉红色。将切片置于室温下的载片架上，让切片干燥10分钟。随后在1倍PBS缓冲液中重新水化切片10分钟。

接下来，使用含0.5% Triton X-100的1×PBS对组织进行通透处理，持续20分钟。然后用2×SSC缓冲液洗涤切片三次，每次洗涤10分钟，并将切片置于2×SSC缓冲液中，直至抗原修复缓冲液加热完成。进行抗原修复时，需将柠檬酸盐缓冲液在微波炉中预热至沸腾。

将200毫升缓冲液加入玻璃载玻片托盘中，然后将托盘置于盛有500毫升蒸馏水的大容器内，加热缓冲液至沸腾。随后将载玻片转移至该托盘中。

确保玻片在微波炉中被缓冲液完全覆盖。将玻片在缓冲液中加热约20秒，直至缓冲液达到沸腾。切勿让缓冲液沸腾溢出。

然后将切片在室温下冷却两分钟，并重复加热循环六次。为了确保抗原修复步骤的可重复性，必须通过实验确定加热循环的次数和持续时间。这包括微波炉、托盘、容器以及托盘中缓冲液体积等因素。

加热结束后，容器中的水体积应保持相同。在通风橱中将载玻片转移至两倍浓度的XSSC溶液中浸泡五分钟，随后将载玻片在甲醇、乙酸与PBS按3:1:4比例配制的溶液中孵育15分钟。然后将载玻片在新配制的甲醇与乙酸按3:1比例混合的溶液中孵育15分钟。

现在将切片依次在70%乙醇中孵育10分钟进行脱水，随后在纯乙醇中孵育两次，每次10分钟。将载玻片在室温下干燥10分钟，以备探针杂交。将80微升探针溶液逐滴加至干燥的切片上，并加盖盖玻片。

检查探针溶液是否覆盖盖玻片的整个表面，并确保无气泡存在。然后用橡胶胶水密封盖玻片并使其干燥。随后进行变性步骤：将玻片在80摄氏度下孵育5分钟。

然后迅速将载玻片转移至置于冰上的金属托盘中，冰浴五分钟。次日，在37摄氏度下进行过夜杂交。用镊子将载玻片置于37摄氏度的加热块上，去除橡胶胶水。

用手术刀刀尖轻轻移去盖玻片。接着，用 SSC 反复清洗切片。然后，将样品置于含适当染料（如 DAPI 或 Hoechst 33342，浓度为 0.5 微克/毫升）的 XPBS 溶液中染色 0.5 微克/毫升）的 XPBS 溶液中染色 10 分钟。

然后用1×PBS将载玻片洗涤三次，每次洗涤10分钟。第三次洗涤后，尽可能沥干载玻片上的液体。接着在每张载玻片的末端各加入80微升含有抗荧光淬灭剂的封片介质。

缓慢用高光学质量的盖玻片覆盖培养基，避免产生气泡。然后用指甲油密封玻片，并在4°C避光保存。在本方案的开发过程中，测试了多种盐缓冲液用于抗原修复。

尽管EDTA缓冲液容易对组织造成损伤，但柠檬酸钠-三羟甲基氨基甲烷（Tris）、盐酸（HCL）和蒸馏水适用于HSV-1的检测，以验证该方案可与商用探针兼容。HSV-1潜伏基因组的检测使用了购自Enzo Biochem的PAN HSV-1生物素化探针，可检测到HSV-1基因组的单个及多个斑点模式。

此外，DNA FISH 方案在感染了三种常用 HSV-1 毒株的小鼠和兔身上进行了测试。在所有情况下，HSV-1 基因组均显示出亮度和强度可变的斑点状信号。另外，通过对患有全身性疱疹感染的小鼠组织进行 DNA FISH，验证了该方案在 HSV-1 复制周期中的适用性。

在这些动物中，可在多种组织（包括背根神经节、眼睛和脑）中检测到大量且明亮的单纯疱疹病毒一型基因组聚集体。DNA FISH 方案具有高度通用性，可实现单纯疱疹病毒一型基因组与病毒或细胞 RNA 及蛋白质的共检测。

例如，可同时检测HSV-1基因组与其HSV-1潜伏期相关RNA；同时检测HSV-1基因组与细胞蛋白（如着丝粒蛋白CENP-A）的方法已被应用；还进行了HSV-1与染色质及PML核小体相关蛋白ATRX的共定位检测。通过三重染色法可同时显示：红色标记HSV-1 DNA，其RNA转录产物lat呈蓝色，ATRX呈绿色。

一旦完成去屏蔽设置，DNA FISH 实验流程就非常稳健。每批可同时处理 20 张或更多载玻片，且整个过程可在 24 小时内完成。该技术的发展将使研究疱疹病毒及其他持续性病毒的科研人员能够在单细胞水平上探究细胞组分和细胞核结构如何影响这些病毒的生物学特性。