分选 链霉菌属 使用复杂物体参数分析仪和分选器制备细胞沉淀

本实验的总体目标是利用大型颗粒 COPA 流式细胞仪，按大小对丝状链霉菌形成的菌丝体颗粒进行分选。首先培养目标细菌菌株并进行取样，完成第一步；第二步则使用 coppa 对样品菌株进行测量。

随后通过计算机对数据进行分析，并根据用户自定义的参数对菌丝球进行分选。最终，这些分析可用于进一步表征菌丝球大小的异质性。尽管该方法可用于链霉菌，但也适用于其他生物体，如丝状真菌。本实验流程将由本实验室的博士生 MaRous Petrus 演示。

首先，向一个无菌的 250 毫升锥形瓶中加入 100 毫升酵母提取物、麦芽提取物培养基和 0.2 毫升 2.5 摩尔的氯化镁，每个细菌样品均需配备金属螺旋弹簧。然后，每个锥形瓶接种 1 × 10⁸ 个链霉菌孢子，使孢子浓度达到 1 × 10⁶ 个孢子/毫升，并在 30 °C、180 RPM 振荡条件下培养细菌。两天后，使用无菌的 5 毫升移液管，在轻轻振荡锥形瓶以均匀分散细胞的同时，从每种培养物中收集 5 毫升样品。

然后将每个样品分别加入到单独的15毫升锥形离心管中。若需通过流式细胞分析仪检测样品，需确认流式细胞仪的计算机和488纳米氩激光器已开启，然后打开生物源软件。确认鞘液瓶已装满且废液瓶为空，随后点击“开始”并运行。

在约60秒后，将488纳米氩离子激光器从待机状态切换为开启状态，激光器将准备就绪。点击“完成”，然后检查压力表。单击压力旁边的复选框。

然后，在系统对流式细胞仪的流动池完成预冲洗后，确认延迟设置为11，宽度设置为7。将信号阈值设为50，飞行时间最小阈值设为40。随后，移除样品杯中残留的水。

加入约 50 毫升 PBS，然后向杯中加入 0.1 毫升的其中一种链球菌脱敏样本。确保杯子已正确关闭，然后单击“采集”以开始收集数据。调节流速，使每秒获取 30 至 50 个事件，直至至少收集到 2,500 个事件为止。

单击、停止，然后存储数据，以供后续统计分析，用于对每个样本的细菌沉淀物进行分选。首先设置分选界限，并输入飞行时间最小值和最大值的详细信息。或者，选择区域，然后定义门控区域，以创建用于选择具有理想尺寸和特性的沉淀物的范围。

放置一个50毫升离心管，用于收集符合分选参数的颗粒。然后设置需分选的颗粒数量，点击手动分选，以针对所选参数进行分选。分选完成后，移除剩余样品，并用水冲洗样品杯两次。

关闭copus之前，使用70%乙醇清洁样品杯。然后运行系统两次：第一次使用含氯水，第二次使用纯水，之后排空溢流容器。清洁完成后，单击停止以释放系统压力。

当电机停止后，关闭程序并点击关机，无需冲洗。然后关闭计算机、copa、激光器和泵。链霉菌形成菌丝球和液体培养物，其尺寸范围较广。

为了分析沉淀物的粒径分布，将一株培养两天的液体生长链霉菌（streptomyces cila color）培养物使用配备1毫米喷嘴的Copus Plus分析仪进行大颗粒流式细胞术检测。此处显示的是典型的Copus输出散点图，横轴代表飞行时间。

颗粒越大，通过激光束所需的时间就越长。Y轴表示消光值，代表物体的光密度，每个数据点对应一个单独通过激光束的颗粒。将数据点绘制成直方图后显示，该代表性样本的颗粒大小分布不符合正态分布。

分布似乎向右偏斜。对数据集进行转换后仍未得到正态分布。为了评估是否可以通过假设由两种正态分布混合来解释尺寸分布，对该数据进行了数学建模。建模结果确实表明存在两个颗粒群体：一个小颗粒群体，占所有颗粒的92%，平均尺寸为248 µm；另一个大颗粒群体，占所有颗粒的8%，平均尺寸为319 µm。

此处展示了从大颗粒群和小颗粒群中分选得到的微菌落的代表性分析结果。两种群的平均颗粒大小被用于界定分选边界，以限制来自两个尺寸分布重叠区域的颗粒被分选：小于248微米的颗粒被视为来自小颗粒群，而大于319微米的颗粒则被视为来自大颗粒群。对分选后颗粒的显微分析证实了它们在尺寸上的明显差异。

还可以采用下一代测序或蛋白质组学等其他方法来揭示这种异质性的潜在机制。