可视化神经母细胞胞质分裂过程 秀丽隐杆线虫 胚胎发生

以下实验的总体目标是在秀丽隐杆线虫胚胎发育过程中，观察发育组织内正在进行分裂的细胞。为了研究调控细胞分裂的基因，首先需要构建或获取一种稳定表达转基因标记的秀丽隐杆线虫品系，该标记可用于标识目标细胞。第二步是通过将双链RNA喂给L4幼虫，持续24至48小时，以特异性敲低目标基因。

从图形雌雄同体中收集RNAi胚胎，并将其转移至aros垫上进行活体成像。接着，利用宽场或共聚焦显微镜对胚胎进行成像，以观察细胞分裂表型。实验结果将展示神经母细胞在海胆胚胎发育过程中的分裂方式，以及参与其分裂所需基因的功能。

该方法有助于揭示发育生物学和细胞生物学领域中的关键问题。例如，该方法可揭示参与调控组织发育过程中有丝分裂、细胞间通讯、细胞迁移或细胞极性相关基因及机制。使用在对照或RNAi平板上培养24至48小时并表达相应标记物的转基因线虫。

选取四到六条成年线虫，转移至凹玻片中20到30微升的M9缓冲液内。为释放胚胎，使用无菌解剖刀在受精囊或阴门两侧切开虫体。接着，用连接在吸头球上的拉制毛细管收集胚胎，该毛细管口径需足够大以允许胚胎通过。最后，使用粘附在牙签上的睫毛将胚胎转移至新制备的琼脂垫上。

通过将胚胎相互推挤，形成每组五到十个胚胎的群体。用盖玻片覆盖载玻片，必要时添加更多M九缓冲液，然后用预热的液体封片剂密封盖玻片。使用配备自动滤光片的落射荧光宽场显微镜。

目标是使用高分辨率CCD相机和高度自动化的载物台，所有组件均由软件控制。尽管该系统未采用LED光源，但使用E-M-CC-D相机结合低倍率可限制对胚胎的光毒性。

手动调整焦距以观察胚胎中的神经母细胞。在宽场显微镜下增加放大倍数，选择正处于背侧间充质融合或腹侧闭合早期的胚胎。选用GFP和德克萨斯红滤光片，并在宽场系统上确定最佳的Z平面。

减少Zacks数量和时间点可降低光毒性，同时将孔径关闭至30%，如有可能，进一步降低光照强度也可减少光毒性。或者，可使用配备软件控制扫描激光物镜、E-M-C-C-D相机和高度电机化载物台的实时扫描扫场或转盘共聚焦显微镜。在完成采集参数优化后，即可在宽场显微镜上对胚胎进行成像。

建议先拍摄对照组胚胎，再拍摄RNAi胚胎。使用扫场系统时，将488 nm和561 nm的100毫瓦激光器功率设为40%，狭缝宽度设为50，曝光时间为300毫秒。

需要注意的是，其他显微镜的设置可能有所不同。将玻片放置在显微镜载物台上，先使用低倍物镜找到胚胎，然后切换至60或100倍油镜。

聚焦后，每2分钟采集一次Z轴图像序列，每次间隔0.2微米，共采集20组Z栈，总计10分钟。曝光时间可能需要调整。通过荧光显微镜对活体胚胎进行成像时，必须考虑光毒性，可通过缩小光圈、减少Z栈层数或时间点数来减轻。

如果可能，缩短曝光时间可限制光毒性。使用宽场（SW field）或转盘共聚焦显微镜有助于改善此问题。利用采集软件确定您感兴趣的时间点、位点和Z平面。

将所需图像导出为多个 TIFF 文件。在 Image J 等图像处理软件中打开每个时间点和感兴趣通道对应的 Z 平面，创建堆栈，因为神经母细胞通常仅跨越少数几个平面。对每个时间点的 Z 平面进行堆栈处理，并生成 Z 堆栈投影。

对其他通道重复此操作。完成所有所需时间点的 Zack 投影后，打开投影以创建时间序列。对每个通道分别进行此操作。

针对每个通道，根据需要调整亮度和对比度。如有必要，旋转图像。然后选择感兴趣区域并对图像进行裁剪。

现在使用合并通道功能创建一幅合并图像，并为每个通道选择不同的颜色。将合并后的图像保存为RGB文件，以便更清晰地观察图像。

使用16位TIFF图像，在编辑菜单下选择反相功能，为每个通道创建灰度图像。为了将感兴趣物体的尺寸换算为微米，绘制一条线并将其长度乘以像素尺寸，像素尺寸由成像参数确定。然后，制作一个代表计算所得微米长度比例的标尺。

最后，将最终图像保存为8位TIFF格式。如有需要，可使用ImageJ将TIFF图像转换为视频。秀丽隐杆线虫（C. elegans）的表皮形态发生是由于表皮细胞形状改变、迁移和黏附共同作用的结果，这一过程还得到下方增殖性神经母细胞的协助。

表皮细胞迁移至腹侧中线并形成单层细胞，用于研究神经母细胞分裂的胚胎。在腹侧闭合过程中，使用更高倍数的显微镜观察了稳定共表达绿色荧光蛋白（GFP）标记的神经母细胞特异性标记物和母源驱动的mCherry标记的膜标记物的胚胎。神经母细胞被可视化为正在进行分裂的状态，其中神经母细胞的细胞核显示为绿色，周围膜结构显示为红色。在对照胚胎中，利用延时成像技术结合mCherry膜探针标记的分裂中神经母细胞轮廓，通过宽场显微镜采集图像，以更清晰地观察对照胚胎中分裂的神经母细胞。每个荧光通道均保持灰度显示，并使用扫场共聚焦显微镜对图像进行反相处理。

在具有分裂神经母细胞的区域，对共表达 H2B-GFP 和 M-Cherry-pH 的胚胎进行了成像。经 RNAi 处理以敲低 anillin 表达的相同胚胎，使用宽场显微镜进行观察。与对照胚胎不同，许多神经母细胞在分裂过程中停滞或退化，并通过扫描场显微镜观察到其变为多核状态。

此外，许多成神经细胞在分裂过程中停滞或退化，变成多核细胞。该技术还可用于成像组织形成过程中迁移的细胞。同时，如果使用您的Zacks以实现更快的成像，则可以获得有关亚细胞动态的更多信息。

此外，在配备适当设备的情况下，该技术还可用于激活光可调探针以进行光遗传学实验。同时，也可应用如FRET或FRET等显微技术来研究蛋白质、蛋白质相互作用或蛋白质动态。