一种用于从人类细胞生产分泌蛋白的便捷通用表达平台

在本视频中，我们介绍了一种从瞬时转染的 HEK293T 细胞中高效表达分泌蛋白的时间和成本节约方法。首先，在六孔板中培养至约 40% 汇合度的 HEK293T 细胞。然后，通过将 GeneJuice 转染试剂和目的质粒分别用无血清培养基稀释，制备转染混合物。

将转染混合物加入细胞中，随后在37摄氏度下孵育，以促进蛋白表达。可通过蛋白质印迹法（Western blot）检测上清液中的蛋白。一旦鉴定出合适的构建体，即可使用10层细胞工厂进行放大实验。

使用PEI作为转染试剂进行细胞转染。通过切向流过滤结合亲和层析，可从培养上清中收获蛋白质。最终，该平台可实现多种大分子以毫克级产量表达。

与现有的杆状病毒昆虫细胞表达等方法相比，该技术的主要优势在于可在三周内完成大量构建体的筛选及表达放大。演示该实验流程的将是来自我实验室的三名研究生：Hello Aiden、Shada Zini 和 Jonathan Cook。首先，在六孔板中每孔接种 250,000 个 HEC 293T 细胞，每孔加入 1 毫升体积的含 10% FBS 的 DMEM 培养基，然后轻轻晃动培养板，使细胞均匀分散。

然后将细胞在37摄氏度、含5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育过夜。当细胞融合度达到约40%时，弃去上清液，加入2毫升新鲜培养基以制备转染混合物。首先，在一个无菌离心管中分装90微升无血清DMEM培养基。

然后加入3 µL基因转染试剂（gene juice），轻轻混匀管内溶液，并在室温下孵育5分钟。接着，加入10 µL浓度为100 ng/µL的质粒DNA（经小量制备纯化）储备液，用于转染。

混匀管内溶液，室温静置15分钟。进行转染时，将混合物滴加至HEK 293T细胞上，逐滴加入，并轻轻晃动培养板，使转染混合物均匀分布。

然后将细胞在37摄氏度下孵育。24小时后，向每个孔中加入1毫升新鲜培养基，并继续孵育48小时。转染后第3天，收集上清液，并通过蛋白质印迹法检测目的蛋白的表达水平。

一旦确定了合适的质粒构建体，即可扩大转染操作的规模。使用10层细胞工厂，向细胞工厂中加入1.2升添加了5%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基。然后加入2亿个HEK 293T细胞，并将细胞均匀分布至所有层中。

四个 T 225 平方厘米的细胞培养瓶在长至 100% 汇合时约含有 2 亿个细胞。将细胞在 37 摄氏度下孵育过夜。在 T 75 培养瓶中配制转染混合物，将 840 微克 DNA 溶于 84 毫升无菌 1 倍 PBS 中。

加入2.5毫升浓度为1毫克/毫升的聚乙烯亚胺溶液（PEI），室温孵育15分钟。溶液应变得浑浊。随后，将转染混合物缓慢倒入细胞工厂中，并充分混匀。

总体层数。加入丙戊酸，使其终浓度为 4 毫摩尔/升。在转染混合物加入后，可提高表达产量。

将培养物在 37 摄氏度下孵育四天，以进行蛋白表达。转染后第四天收集培养基，并立即清洗细胞工厂以备重复使用；将收集的培养基在 4 摄氏度下以 6,000 G 离心 30 分钟，并通过 0.22 微米无菌杯式真空过滤装置过滤，以去除任何颗粒物质。然后使用 Centra Mate 切向流过滤系统将上清液浓缩至 75 毫升。

当上清液浓缩后，可通过亲和层析纯化目标蛋白。在本实验中，我们使用此处所述的大规模系统纯化了人AAL两种受体胞外域的HA标记亚基，随后进行高亲和力抗HA层析。如本图所示的考马斯亮蓝染色SDS-PAGE分析结果。

白介素-2受体α亚基和γ亚基的胞外域在SDS-PAGE凝胶电泳中的迁移分子量分别为40千道尔顿和46千道尔顿。IL-2Rα和IL-2Rγ上存在的EnLink糖链的异质性导致电泳条带展宽。较高分子量的条带代表污染的牛血清白蛋白（BSA）。

观看本视频后，您应能够充分理解如何利用10层细胞工厂通过人源细胞培养表达蛋白。请注意，HC 293 T细胞具有生物危害性，须在生物安全二级条件下操作。请始终穿戴适当的个人防护装备，并根据机构及政府指南对操作表面进行消毒。