利用机器人微接触印刷（R-µCP）与连续亲核取代反应制备复杂细胞培养基底

以下实验的总体目标是制备具有多种微图案 PEG 刷的组织培养基底，这些 PEG 刷呈现正交化学特性，从而实现生物配体在空间上精确定位和位点特异性的固定化。该目标通过机器人微接触印刷技术在金包被的基底上沉积含有硫醇的 A TRP 引发剂阵列来实现。第二步是在微图案基底上进行 SI A TRP 反应，生成带有末端溴基团的 PEG 刷。

接下来，将末端溴原子修饰为一个或两个化学反应基团，以实现对适当制备的生物配体进行光引发固定。随后，重复整个过程以修饰第二种化学基团。结果表明，两种正交功能化的聚乙二醇（PEG）刷状结构微阵列可实现10微米精度的叠加。

通过将反应基团与荧光分子偶联后，使用定制的图像分析软件进行验证。与手动微接触印刷等方法相比，该技术的主要优势在于，机器人微接触印刷能够以微米级精度叠加多个印刷步骤，同时实现最大程度的灵活性和基底设计自由度。该方法所提供的精确性，结合顺序进行的亲核取代反应，使我们能够制备出经多种生物配体功能化的组织培养基底，从而在微米尺度上实现对硫酸化过程的时间和空间控制。

在进行S-I-A-T-R-P之前，应使用A-P-D-M-S印章对镀金盖玻片进行图案化处理。这一相对常见的操作步骤在文本方案中有详细说明。首先通过释放真空，将载片从机器人装置上取下。

然后将其转移至一个50毫升的sch长度烧瓶中，密封烧瓶，并施加-30 PSI的负压。接着用注射器向烧瓶中加入5.5毫升A TRP反应混合物，再通过注射器加入0.5毫升溶于水的L-抗坏血酸钠。观察反应液颜色由浅绿色变为深棕色。

在惰性气体氛围下继续反应16小时。反应完成后，取下盖玻片，依次用乙醇、水和乙醇冲洗，然后用氮气轻轻吹干。

接枝的P-E-G-M-E-M-A刷状微阵列应能用肉眼观察到。使用显微镜详细观察以叠氮基团功能化的P-E-G-M-E-M-A链。将带有图案的盖玻片转移至20毫升玻璃反应小瓶中，并加入6毫升含有100毫摩尔叠氮化钠的DMF溶液。

在37摄氏度下反应24小时。第二天，用乙醇冲洗洁净盖玻片，并在温和的氮气流下干燥，以稳定剩余的溴功能化P-E-G-M-E-M-A链。将微图案盖玻片转移至一个20毫升的玻璃反应小瓶中，加入6毫升含有100毫摩尔乙醇胺和300毫摩尔三乙胺的DMSO溶液。

第二天在 40 摄氏度下让该反应继续进行 24 小时。用乙醇冲洗图案盖玻片，并在氮气流下轻轻吹干。下一步是使用第二个 PDMS 印模重复机器人微接触印刷，并进行后续的印迹操作。

再次使用SI A TRP绘制第二个微阵列PEG刷。接下来，弗朗索瓦，需要对第二个微阵列P-E-G-M-E-A链进行炔基功能化。微图案覆盖。

将六毫升 100 毫摩尔的丙烯胺 DMF 溶液加入 20 毫升玻璃反应小瓶中。让反应在室温下进行 24 小时。次日，在室温下用乙醇冲洗载玻片，然后在温和的氮气流下干燥。

随后，专利盖玻片即可进行生物素偶联。首先将微型专利盖玻片放入一个20毫升的玻璃反应瓶中。第一步，使生物素与末端带有炔基的链发生反应。

向反应小瓶中加入六毫升硫酸铜与叠氮 PEG4 生物素缀合物，随后加入1.2毫升0.15毫摩尔的水合核黄素以启动反应，用氮气鼓泡10秒，然后用封口膜密封小瓶，反应持续24小时。

第二天室温下，用水冲洗盖玻片，并将其转移至12孔聚苯乙烯培养板中。随后在室温下，用含驴血清的DPBS孵育一小时，一小时后，在DPBS中加入终浓度为每毫升2微克的链霉亲和素-DEIN 546偶联物，对生物素标记的靶点进行染色，室温避光孵育两小时，两小时后用DPBS轻轻振荡冲洗盖玻片五次。

用 Tobi ITIN 终止链反应。将盖玻片放入六孔聚苯乙烯板的一个孔中，并加入含有 20 微摩尔 D-B-C-O-P-G 四生物素的两毫升 DPBS。然后在室温下孵育盖玻片 24 小时，24 小时后。

将盖玻片如前所述冲洗四次，并用链霉亲和素 488 偶联物在 DPBS 中以每毫升 2 微克的浓度进行染色。两小时后。

再次冲洗盖玻片，然后使用显微镜对其进行成像。采用此机器人微接触印刷方案，在具有末端叠氮基团的较大PEG刷状阵列内，成功图案化出具有末端炔基的精确排列的PEG刷状阵列。

通过点击化学反应和荧光探针的链霉亲和素结合，观察叠氮基团和炔基团的空间分布。两个荧光通道的叠加图像显示，印章图案未发生重叠。对准精度被计算为低于10微米，达到SCAR的极限。

用于执行打印的系统。观看本视频后，您应能充分理解如何利用机器人微接触打印技术叠加多个点刷阵列，以制备定制的组织培养基底，并通过正交化学方法进行功能化。