高通量合成碳水化合物及聚酸酐纳米颗粒的功能化

在本视频文章中，我们介绍了一种新型的水相合成法，用于自动化液相合成寡糖以及聚酸酐纳米颗粒的功能化。利用这些基于碳水化合物的靶向剂，首先使用自动化系统合成碳水化合物分子，该系统采用液相合成而非固相合成仪。接着，通过弗洛里硅土固相萃取（FSPE）对寡糖中间体进行纯化。

所制备的碳水化合物分子通过核磁共振（NMR）进行表征，然后通过碳酰亚胺偶联反应连接到聚酸酐纳米颗粒上。最后，采用X射线光电子能谱和疏水性苯酚-硫酸法对碳水化合物功能化的纳米颗粒进行表征。最终，通过采用此处所述的疏水性分析方法，已获得优化纳米颗粒形貌及颗粒表面碳水化合物密度的反应条件。

与现有的固体表面寡糖合成等方法相比，该方法的主要优势在于所用构筑单元的用量显著减少。在该方法中，通常使用两到三个当量，而非十到二十个当量。我们最初是在研究表面效应的有效性时提出该方法的设想，即利用碳水化合物对多羟基纳米颗粒进行功能化，以靶向抗原呈递细胞上的C型凝集素受体。随后，我们希望设计一种高通量系统，以实现对这些新型载体在制备和应用过程中涉及的多个参数进行筛选。

该方法的可视化演示至关重要，因为用于寡糖高通量合成及其与聚合物微粒连接的自动化平台尚属新兴研究领域，相关文献记录较少。在进行二酸的自动化合成之前，需在实验台面上制备适当保护的糖供体（通常为三氯乙酰胺衍生物）和主要位于醇类或含氟醇中的受体，并将其溶于氯甲烷中；同时，将三甲基硅基三氟甲磺酸酯溶于氯甲烷，另分别配制80%甲醇和100%甲醇溶液。确保自动化反应舱内环境的相对湿度为30%或更低。

高湿度对糖基化反应有害。以下步骤使用自动化平台完成。第一次糖基化反应使用供体和花醇进行。

完成后，通过 FSPE 纯化得到的花体标签糖分子。随后用钠、甲醇钠和甲醇去除临时保护基团，再次通过 FSPE 纯化产物。之后，将花体标签糖作为受体，与相同的供体偶联得到二糖，该二糖通过 FSPE 纯化后即可开始后续操作。

将试剂（包括供体、受体、促进剂、80%甲醇水溶液、100%甲醇和甲醇钠）放入 robotic 平台，并启动程序。机械臂将从样品瓶中依次吸取供体和受体，并转移至反应瓶中。随后，供体与受体的混合物搅拌 30 分钟。

30 分钟后，机械臂将催化量的三甲基硅基、三氟甲磺酸酯转移至混合物中。随后将溶液再搅拌 30 分钟。搅拌完成后，程序暂停。

取出10微升等分试样，通过薄层色谱法检测反应是否完成。若反应已完成，则受体分子将不可见；若反应未完成，则薄层色谱上仍可见受体斑点。

如果确实如此，则停止程序，将糖基化反应时间重置为约30分钟，并加入过量的促进剂三甲基硅基三氟甲磺酸酯。反应完成后，继续进行下一步操作。反应结束后，机器人将反应混合物转移至含有九氟十七烷基修饰的硅胶的固相萃取（FSPE）柱中进行纯化。

接下来，用8 mL 80%甲醇洗涤小柱，随后用8 mL 100%甲醇洗涤。为去除非弗洛里斯组分，收集流出液至小瓶中，以获得所需的弗洛里斯标记产物。如果需要进一步纯化，可暂停机器人操作，并移除相应的反应产物。

根据结构的不同，供体可能极不活泼，即使加入足量促进剂，仍可能残留部分氟化受体分子。若出现这种情况，固相萃取（FSPE）的纯化效率将不足，可在机械臂向反应小瓶中加入甲醇钠后，进一步通过硅胶柱色谱法进行额外纯化。随后在机器人平台上搅拌反应两小时；若薄层色谱（TLC）检测显示反应未完成，则将孵育时间延长约一小时。

反应完成后，按前述方法通过FSPE对产物进行纯化。随后，将反应产物从机器人系统中取出，在台面上用无水甲苯溶解，然后蒸发以除去残留水分。样品干燥后，将其重新放回机器人系统中，重复包括通过FSPE进行糖基化纯化的相同循环。

深度保护临时保护基，随后进行糖基化反应，重复此过程直至目标分子达到所需的链长，然后对自动化合成得到的保护产物进行脱保护，并将小瓶从机器人装置中取出。该方案的最后步骤需使用易爆的氢气，必须在自动化平台之外进行。在台面上，荧光标记中的双键发生裂解，随后将生成的醛基氧化为羧酸。

使用二氯甲烷中含30%甲醇的混合溶剂，在台式硅胶柱上对所得产物进行柱层析纯化。最后，通过钯催化氢化反应脱去苯甲醚保护基，将产物通过一个卫星垫以去除钯，从而得到纯净的最终产物。使用核磁共振（NMR）波谱法对产物进行充分表征。

高通量聚合物合成与纳米颗粒制备按照 Peterson 等人所述的方案进行。如随附文档中所述，用于颗粒功能化的自动沉积装置包含三台 ne 1000 泵、一个由两个执行器集成的机器人平台（一个用于 X 方向运动，另一个用于 Y 方向运动），以及第二个带有两个相邻支架的机器人平台，该平台包含三个执行器（每个方向各一个）用于控制泵，总共连接了五个执行器。这些执行器和泵通过计算机使用 LabVIEW 软件进行串联操作。

用于颗粒制备的共聚物体系基于SEBA酸或SA，以及一种六(对羧基苯氧基)乙烷（CPH）或一种十八(对羧基苯氧基)-3,6-二氧杂环己烷（CP-Teeg）。在完成纳米颗粒制备后，将含有1.7毫升离心管的纳米颗粒文库置于线性驱动器平台上，用于将碳水化合物连接到聚酸酐颗粒表面。该过程采用平均羧酸偶联反应，包含两个连续的反应步骤。在第一步反应中，使用程序控制的注射泵，将注射器中分别含有EDC和乙二胺的水溶液注入，其浓度分别为每毫克纳米颗粒2毫克和每毫克纳米颗粒0.6毫克。

用一个可编程的注射泵中的第二个注射器吸取 NHSA 颗粒溶液，浓度为每毫克颗粒 2.5 毫克 NHSA，总量为每纳米粒子样品 12 当量，水溶液。接下来，通过 LabVIEW 程序指示机器人将试剂悬浮液加入纳米粒子文库中。机器人执行器将带动试管架移动至平台上的正确位置，以便分配 EDC 和 NHS 溶液。

活化聚酸酐纳米颗粒表面的羧基，并进行平均偶联。接着，将超声探头浸入每个试管中，以40赫兹对每个样品超声处理30秒。在处理下一个样品前，用丙酮清洗探头。

所有样品加样完毕后，将试管架从 robotic 平台取下。将纳米颗粒悬浮液在 4 °C 条件下持续旋转孵育 9 小时。可根据需要调整第一和第二步反应的反应时间，以调节最终的糖浓度。

反应完成后，在12,000 ×g 条件下离心试管5分钟。在低温环境中，将样品返回至机器人工作站。将试管架重新连接至机械臂，并填充机器人平台上的第二个注射器。

使用冷水时，第一个注射器应保持为空。启动机器人后，每个管中的上清液将被吸入空注射器中，同时第二个泵将冷水注入管中。

此步骤旨在去除纳米颗粒悬液中任何未反应的试剂。接着，通过超声处理使纳米颗粒悬液均质化，操作方法如前所述。然后在12,000 ×g 条件下离心5分钟。

使用机器人装置进行第二次冷水洗涤，将每纳米粒子样品12当量的EDC加入第一泵，每纳米粒子游戏副本12当量的NHS加入第二泵。启动机器人平台，向含有纳米粒子的试管中分配适量试剂。EDC和NHS的存在将促进已连接在纳米粒子表面的乙二胺中的氨基与深保护糖的羧基之间形成酰胺键。

沉积完成后，加入10当量的特定糖类。本实验中使用了乳糖，并在两个可用的泵中分别设置羟基乙酸作为对照。根据每根试管所需的特定功能化修饰，将每种糖类分别沉积到相应的试管中，该过程由LabVIEW程序预先设定，用于控制执行本研究所用反应的驱动装置和泵功能。在碳水化合物连接实验中，使用羟基乙酸作为连接子对照，因为深度保护的糖类已共价连接该分子，从而可进一步与纳米颗粒表面结合。

纳米颗粒悬浮液通过超声处理均质化，方法同前，然后在4摄氏度下持续旋转孵育9小时。孵育结束后，通过离心洗涤纳米颗粒悬浮液，弃去上清液，随后将沉淀物重悬于冷水中，并进行超声处理。将含有功能化纳米颗粒文库的试管置于真空干燥箱中，干燥至少2小时。采用动态光散射及其他方法对功能化纳米颗粒进行表征，以评估其表面组成、浓度、粒径、粒径分布及表面电荷。

此处所示的完全保护的diano侧链是使用自动化平台合成的。合成化合物采用VXR 400兆赫核磁共振波谱仪进行氢核磁共振（1H NMR）表征。以CDCl3为溶剂，通过若干特征峰的存在可确认产物的生成。

在质子核磁共振图谱中，化学位移位于1.79至2.21处的四个质子和3.38处的两个质子来自荧光素标记。2.16处的单峰对应于乙酸酯峰，4.94和5.11处的峰为异头质子，用于评估反应时间对纳米颗粒最终形貌及糖基团连接程度的影响。如图所示，随着反应时间的延长，纳米颗粒被逐步功能化，50/50 CPT/CPH纳米颗粒表面的二乙醇胺浓度随反应总时间的增加而升高，并在18小时后达到最大值。

使用总反应时间为24小时的功能化纳米颗粒，通过流式细胞术评估其靶向小鼠骨髓来源树突状细胞上C型凝集素受体（CLR）的能力，结果如图所示。在用非功能化以及乳糖和岩藻糖功能化的纳米颗粒刺激后，均观察到DC-SIGN和甘露糖受体（C型凝集素受体）的表达增加，表明实现了有效靶向。

然而，Diano 功能化颗粒显示出更高的表达水平，表明该配体对所研究的受体具有特异性。观看本视频后，您应充分了解如何进行寡糖的高通量自动化合成以及聚合纳米颗粒的功能化。利用这些基于碳水化合物的靶向试剂，一旦掌握了供体-受体保护糖的合成以及装置的组装，整个过程可在 24 至 48 小时内完成。

当然，所需时间长度取决于文库的大小以及功能化反应的时间。在采用该方法时，需要注意的是，您可以根据纳米颗粒的化学性质优化可生物降解聚羟基颗粒功能化的反应条件。通过遵循此操作流程，可合成多种结构的碳水化合物，以靶向不同的细胞受体，从而调控免疫学效应。