利用多步链置换光刻技术实现基因的功能性表面固定

DNA生物芯片是一种用于自合成生物学的有吸引力的研究平台，最初由BASF集团开发，可实现体外基因线路在较长时间内的运行。通过本方案，我们希望使该技术能够被更广泛的研究人员所使用。我们的方法称为bephore光刻技术，代表了一种基于DNA链置换反应的DNA固定化策略。

该技术的优势在于其多步光刻能力、操作简便且可重复，以及所有组件均可商业化获得。与其他生物芯片解决方案类似，bephore 可与不同技术结合使用。例如，可在微区室中组装功能性基因刷以实现蛋白质表达。

首先，在玻璃烧杯中将五份水与一份30%氨水溶液混合，配制RCA溶液。在加热板上边搅拌边将混合物加热至70摄氏度。当温度达到70摄氏度时，加入一份30%过氧化氢。

然后将一片直径为100毫米的硅片放入溶液中，以去除其上的有机物和颗粒。30分钟后，取出基底，用洗瓶中的水彻底冲洗，并用氮气枪吹干。随后立即进行基底的聚乙二醇化（PEGylation）处理。

为此，首先将生物素-PEG-硅烷溶于干燥甲苯中，配制成浓度为 5 毫克/毫升的溶液，并涡旋振荡至充分混匀。将基底置于玻璃培养皿中，缓慢用移液器将溶液滴加到基底表面，确保覆盖整个表面，但避免溶液溢出边缘。表面完全覆盖后，盖上培养皿盖，再额外加盖一层覆盖物。

30分钟后，移去盖子，向培养皿中加入约40毫升异丙醇。然后取出基底，再次用异丙醇彻底冲洗，并用氮气枪吹干。干燥后，将基底避光保存，直至需要时使用。

使用玻璃刀或手术刀制备一厘米见方的基底材料。然后，在基底中心向边缘处轻轻划一道短划痕，作为简单的对齐标记。使用氮气枪吹去芯片表面的微小颗粒。

接下来，混合两滴双组分硅胶，将胶涂抹在芯片表面，但留出划痕尖端周围的区域不涂胶。此处的胶可形成疏水屏障，使水溶液保留在芯片上。这有助于后续的洗涤步骤，并减少孵育所需的DNA用量。

在后续步骤中，胶水可轻松剥离。在接下来的操作中，光裂解 DNA 仅在黄光环境下进行处理。在室温下，将约 10 微升的 bephore 混合物覆盖于芯片上，并将芯片置于部分装有水的盒子中，以减少蒸发。

一小时后，用 PBS 多次洗涤芯片，以去除未结合的偶联混合物。接着，向芯片中加入 10 µL 封闭混合物。两小时后，用 PBS 多次洗涤芯片，以去除未结合的封闭试剂。

将打印好的光刻掩模裁剪至合适尺寸，以适配相应的掩模 holder。将其插入视场光阑的位置，并利用对准标记在 holder 中对准掩模。将基底放置在显微镜载物台上，在照明光路中插入红色滤光片，并聚焦到基底表面。

然后，移动至将要曝光的基底区域。接着，插入掩模架，遮挡照明光源，并更换为紫外滤光片。在较低光照强度下打开快门，利用相机快速将掩模聚焦到基底上。

在基底已对准且掩模清晰对焦后，遮挡通往相机的光路，并以所需的曝光时间用高强度光照照射基底。曝光后，将样品从显微镜上取下，小心地尽可能去除基底上的缓冲液，但不得使其干燥。随后，加入10至20微升含有用于表面附着序列的DNA。

将底物置于湿盒中以防止干燥，并在室温下孵育两小时，使 DNA 固定在底物上。为了在倒置显微镜下观察分区的基因表达，首先需分别准备样品 holder 的两个部分。先使用双面胶带将带有固定化基因刷的 bephore 芯片粘接到芯片 holder 上。

接下来，在夹具底部中央孔周围涂抹一些真空脂，然后插入芯片夹具。现在组装夹具的上部。用刀片切割出带有尽可能小腔室的薄PDMS芯片，并在其中一侧留出一个开放通道，以便后续通过扩散交换废液和前体分子。接着，使用氧气等离子体对PDMS芯片背面的玻璃盖玻片进行等离子体处理。

处理后立即把PDMS芯片放置在载玻片中央，使微室朝上。然后将载玻片与PDMS在70摄氏度下烘烤一小时。在组装整个样品 holder 前不久，用等离子体处理带有PDMS芯片的载玻片，方法同前。

然后，在上部固定器的大孔周围涂抹一些真空脂，将带有 PDMS 的玻片放置其上。轻轻将玻片压向真空脂。小心地从芯片中移除缓冲液，并用 10 微升自表达系统清洗一次。

接下来，将60微升的自表达系统加入芯片中，并去除边缘的双组分硅胶。然后，在PDMS上加入20微升表达系统。将液滴放置到PDMS上后，应立即在体视显微镜下检查，确保各微室充分润湿且无气泡。

如果有气泡，请尝试将其冲洗掉。在体视显微镜下进行操作，以组装支架的两个部分，并对齐样品室和DNA刷。使用夹持臂固定底部支架，以便双手可以方便地接触到两个螺钉和翼形螺母。

将上部夹具插入下部夹具中，并向下移动，直至无细胞表达体系的液滴发生融合。然后，检查确保各个腔室及对齐标记在XY平面上处于相似的位置。从底部拧紧翼形螺母，直至其接触到夹具的底侧。

在将腔室与芯片在 XY 平面内对齐时，应轻轻拧紧翼形螺母。此步骤需要一定的操作经验，并取决于样品 holder 的具体结构。应仅施加轻微的作用力，使 PDMS 轻柔地压在芯片上。

接下来，用清水喷洒防蒸发腔室内的海绵，然后将样品台插入盒中。随后，用5毫升注射器吸取双组分硅胶，并用其密封盒子。最后，将盒子转移至温控显微镜下，通过荧光显微镜观察DNA刷及反应过程。

一种两步光刻工艺，在此以石英玻璃载片为基底进行，可产生重叠的荧光标记DNA链图案。在此芯片上基因表达的演示中，DNA被固定在左侧腔室中。当暴露于表达混合物时，黄色荧光蛋白YPet即由固定的DNA合成。

为了评估基因表达系统的活性，在漂白步骤后观察荧光的恢复情况。在两小时时，荧光强度迅速恢复；然而，在四小时和六小时时，荧光未恢复，表明若无新鲜表达混合物的补充，反应在约四小时左右终止。

尽管在封闭系统中基因表达受到限制，但通过微流控技术向表达区室持续补充前体分子，可使基因表达维持更长时间。bephore 方法可用于固定寡核苷酸或基因长度的 DNA，该技术可应用于构建相互作用的 DNA 刷系统，以实现自驱动的基因表达。该技术还可用于生物物理学中的其他应用，例如单分子荧光研究。

观看本视频后，您应能够利用晶圆或载玻片制备生物芯片，并将其整合到您的科研项目中。