一种高效且灵活的细胞聚集法用于三维球状体的制备

旁白 本方法的总体目标是通过细胞聚集高效地大量生成稳定的细胞球体，用于多种基于细胞的检测。该技术的主要优势在于使用了一种非蛋白质性质的水溶性基质来促进细胞聚集和球体形成，从而实现细胞球体的简便快速分离。该方法有助于深入理解细胞生物学中细胞间及细胞与基质相互作用在三维微环境中对组织生长的影响。

旁白 在制备凝胶前，将50毫升超纯水加热至80摄氏度，加入10克甲基纤维素粉末。搅拌悬浮液，直至颗粒均匀分散。然后加入冷的超纯水，定容至100毫升，并在4摄氏度下静置过夜，直至溶液变为澄清的淡黄色，且无可见固体颗粒。

将溶液通过0.45微米滤膜过滤，以去除任何未溶解的碎片，并用适当的培养基将过滤后的溶液稀释至1:5毫克/毫升。然后将添加了甲基纤维素的培养基通过0.22微米滤器过滤。接下来，在生物安全柜中，用PBS洗涤70%融合度的传代培养物，并在细胞培养孵育箱中加入3毫升胰蛋白酶-EDTA消化缓冲液处理细胞使其脱离。

数分钟后，在10倍物镜下用光学显微镜观察细胞。当细胞从培养板上脱落时，加入7毫升含血清的培养基以中和反应。将细胞悬液转移至一个新的15毫升离心管中，然后通过离心收集解离的细胞。

除了污染颗粒外，导致类球体形成失败的最常见原因是甲基纤维素或血清的浓度未达到针对特定细胞系聚集和生长的最佳水平。旁白：使用带滤芯吸头的P1000移液器，将一毫升类球体形成培养基缓慢吹打沉淀物3至5次，移液器吸头以轻微倾斜的角度紧贴试管底部，吹打过程中缓慢操作，不要将吸头内的全部液体完全排出，以剪切沉淀。计数后，将细胞悬液稀释至浓度为每毫升1×10⁴个细胞，并用过滤的超纯水冲洗无菌多通道移液器储液槽，以去除任何灰尘和纤维。

将细胞加入储液槽中，并使用带滤芯的吸头将100微升细胞悬液转移至96孔U型底防粘附细胞培养板的每个孔中，期间需定期混匀细胞悬液，以防止细胞沉降至储液槽底部。所有细胞接种完成后，将培养板置于组织培养孵育箱中，并每日观察各孔内类球体的形成情况。细胞通常在6小时内沉降至各孔底部，并在24至48小时内聚集成类球体。

为确认成功形成类球体，使用P10枪头在光学显微镜下轻轻将培养基吹打至类球体表面。正确形成的类球体会从培养板上松动并滚动，从而证实其具有三维结构。为将类球体包埋于胶原蛋白中，采用反向移液法，将每孔至少50 µL的中和胶原蛋白溶液均匀覆盖在八孔组织培养腔室载玻片的每个孔底部。

当所有孔均被覆盖后，将腔室载玻片放入盛有超纯水的35毫米组织培养皿中，再置于10厘米组织培养皿内，在37摄氏度下孵育约1小时。当胶原蛋白聚合完成后，使用P1000滤芯吸头小心地将预先形成的球状体转移至1.5毫升微量离心管中。必须将胶原底层充分孵育至完全聚合，以避免在添加球状体或培养基时扰动胶原结构。

讲解员 将收获的类球体在台式微量离心机中收集，使用P200移液器吸除上清液，必要时将离心管倒置在干净的纸巾上，吸去多余的上清液。使用宽口P200移液器吸头，立即将类球体重悬于50 µL中和的胶原蛋白溶液中，并小心地将类球体-胶原蛋白混合物转移至八孔组织培养腔载玻片的每个孔中。将载玻片放回培养箱，直至胶原蛋白完全聚合。

约一小时后，向每个孔中缓慢加入至少 100 µL 含有相应处理因素的预温培养基，继续孵育。然后使用荧光显微镜对侵袭性类球体进行光学成像切片采集。通过本方案，可利用多种细胞系生成类球体。

在适当的甲基纤维素和血清处理条件下，单个细胞会沉降并聚集在孔板中央，相互黏附形成类球体，且对孔板底部的黏附性最低。某些细胞系在缺乏或低浓度甲基纤维素的情况下仍能黏附于抗细胞黏附的培养板上，从而形成被单层细胞包围的类球体。通常情况下，较高浓度的甲基纤维素可阻止细胞黏附于孔板表面。

但甲基纤维素浓度过高会降低细胞间的黏附，阻止细胞沉降到孔板底部，从而形成松散的聚集体和大量卫星状类球体。将包埋于胶原中的类球体用趋化因子处理，可诱导单个细胞从类球体向外侵袭进入周围基质。固定后的胶原包埋类球体可通过明场显微镜成像，以定量分析侵袭细胞的距离和数量，或通过免疫荧光显微镜成像，以观察迁移细胞形成的侵袭结构。

确保细胞有足够时间聚集成结构完整、足够坚固的球状体至关重要，这样在操作过程中不易碎裂，并且能够方便地收集用于后续实验。我们的细胞培养方案还可进一步适用于多种细胞生物学实验。例如，将细胞置于添加了高浓度甲基纤维素的培养基中，可用于评估细胞的非黏附性耐受能力。

观看本视频后，您应能充分理解如何通过聚集法生成三维细胞球体，这将为多种细胞生物学应用提供一种有价值的工具。