一种用于高内涵筛选与分析应用的类球体大规模生产的稳健方法

本方案提供了一种在多孔板的每个孔中生成数百个多功能肿瘤类球体的方法，适用于自动化显微镜观察。所生成的类球体可按不同大小分类，并可从每个细胞中提取亚细胞信息。该技术可产生足量的类球体，可用于直接筛选和RNA干扰研究。

将 ECM 基底膜材料用预冷至零下 20 摄氏度的冷酚红无血清培养基稀释，并使用预冷的吸头操作。取 15 微升 ECM 基底膜材料与培养基的混合溶液加入 96 孔成像板中。将培养板在 4 摄氏度条件下以 91 × g 离心 20 分钟。

在37摄氏度下孵育平板，时间不超过30分钟。向细胞中加入trips和EDTA。在37摄氏度下孵育细胞，孵育结束时，将细胞重悬于含有10% FBS的完全培养基中。

用移液器吸取10微升细胞悬液，加入血细胞计数板的计数室中。计数计数室四个象限中的细胞数量。在室温下以135 ×g离心4分钟。

细胞离心成团后，吸除上清液，并将细胞重悬于不含酚红的完全培养基中，调整细胞浓度至每毫升含10的6次方个细胞。用不含酚红的完全培养基稀释细胞，以每孔35微升的总体积，将细胞悬液逐滴加入孔板中，同时以圆形轨迹轻柔混匀。

将细胞置于含5%二氧化碳的湿润化培养箱中，在37摄氏度下孵育1小时。每孔加入1.2微升ECM基质材料和23.8微升不含酚红的完全培养基，最终每孔体积为60微升。将细胞置于含5%二氧化碳的湿润化培养箱中，在37摄氏度下孵育。

第二天，将培养基更换为 100 微升新鲜的无酚红完全培养基。将含有类球体的 96 孔板放入共聚焦高内涵筛选显微镜中。选择适当的激光以激发所用的荧光染料。

依次采集各通道以避免串色，使用合适的物镜对类球体进行成像。为分析类球体的形态，根据荧光标记的 FLoid 及染色结果对类球体进行分割。根据六三三三四二染色结果对细胞核进行分割。

通过细胞质中残留的 Hex three, three, four, two, two 染色对每个细胞的细胞质进行分割。计算类球体的不同形态学特性，包括体积、表面积、球形度以及每个类球体中的细胞核数量。进一步对图像进行筛选，排除体积小于 75 立方微米和大于 900,000 立方微米的类球体。

为了分析类球体中的单个细胞，需根据荧光标记的类球体染色对类球体进行分割。根据Hoechst 33342染色对细胞核进行分割。通过细胞质中残留的Hoechst 33342染色对每个细胞的细胞质进行分割。

根据二抗染色对溶酶体进行分割。计算每个球状体中细胞的不同形态学特征，包括每个细胞的溶酶体数量、细胞体积和细胞表面积。该图展示了三种不同类型球状体的整体概览，包含不同共聚焦层面的图像。

还展示了整个类球体的体积视图。该图展示了pH分割过程，图A显示了类球体的整体体积视图。图B展示了单个类球体中所有细胞的细胞质、细胞核和溶酶体的分割结果。

细胞质和细胞核根据六三、三、三、四、二染色进行分割，溶酶体则根据抗lab一抗体染色进行分割。图C展示了与图B相同的分割结果，但以三个平面视图呈现。

可在类球体水平上进行多种形态学测量。这些测量包括计算每个类球体中的细胞核数量，以及类球体的圆度、体积和表面积。三种类球体中每个细胞的典型体积。

本图还显示了每个细胞中溶酶体的数量。在SP生成开始时优化初始细胞接种密度是关键步骤。该图表明，即使加入过多的细胞，仍能形成球状体。

然而，这可能导致类球体的融合。以此方法生成的类球体可进行转录组学和蛋白质组学分析。该技术用于定量分析药物递送用纳米颗粒等纳米材料的摄取情况，并评估其对类球体中单个细胞的毒性。