通过串联RNA免疫沉淀测序（RIPiT-Seq）鉴定RNA:蛋白质复合物的足迹

串联RNA免疫沉淀后测序（RIPiT-Seq）是一种用于鉴定特定成对RNA结合蛋白所结合的RNA区域的方法。RIPiT最独特的优势在于其能够在两次纯化过程中靶向两种不同的蛋白质。这种方法能够有效地从其他复合物中富集出具有特定组成成分的RNA-蛋白质复合物。

此外，RIPiT-Seq 不依赖于紫外交联，可应用于多种作用于RNA但不直接与其结合的蛋白质。尽管该方法尚不能直接用于治疗或诊断，但RNA结合蛋白及RNA加工过程已被发现与多种疾病（如神经病变和癌症）相关。RIPiT-Seq为研究疾病相关RNA结合蛋白的功能提供了一种有效工具。

RIPiT-Seq 需要一个能够表达带有表位标签蛋白的系统。该技术目前仅在 HEK293 细胞中进行过测试，最适合用于细胞培养。然而，随着我们利用 CRISPR 对蛋白质进行标记的能力不断提升，RIPiT-Seq 可适用于多种现代研究系统。

RIPiT 的成功取决于两次高效的免疫沉淀，因此优化所用抗体的免疫沉淀条件至关重要。此外，操作 RNA 时需要采取适当的预防措施，因此在 RNA 提取过程中及之后均应使用无 RNase 的试剂。演示该实验流程的是我实验室的研究生 Lauren Woodward。

首先用15毫升预冷的PBS轻轻冲洗15厘米培养皿中的单层细胞。然后将细胞刮入30毫升PBS中，并收集至50毫升锥形管内。在4摄氏度下以400 ×g离心10分钟，沉淀细胞，弃去上清液。

加入4毫升预冷的低渗裂解缓冲液，使用P1000移液器重悬细胞。将裂解液转移至5毫升离心管中，冰上孵育10分钟。将裂解液置于冰浴中，按照文章所述条件进行超声处理。

然后加入108微升5摩尔的氯化钠，将盐浓度调整至150毫摩尔。接着在4摄氏度下以12,000 ×g离心裂解液10分钟，并收集20微升上清液用于Western印迹分析。根据说明书指示预先洗涤FLAG琼脂糖珠，然后将剩余上清液加入装有750微升珠子的5毫升离心管中。

在4°C下，将FLAG琼脂糖珠与细胞提取物轻柔混合孵育一至三小时。孵育结束后，在4°C下以400 ×g离心一分钟，沉淀琼脂糖珠，并收集20 µL上清液用于Western印迹分析。弃去剩余上清液，加入4 mL等渗洗涤缓冲液重悬珠子以洗涤。

再次离心收集珠子，并移除上清液。根据手稿说明，将RNase I用750微升iso洗涤缓冲液稀释后加入FLAG琼脂糖珠中。在4摄氏度下轻轻混匀孵育，然后通过离心收集珠子。

取20微升上清液用于Western印迹分析，其余部分弃去。随后，按前述方法用iso洗脱缓冲液洗涤磁珠。接着，加入375微升洗脱缓冲液至磁珠中，于4摄氏度轻轻振荡1至2小时，进行亲和洗脱。

孵育后，离心收集珠子，并取15 µL洗脱液用于Western印迹分析。在进行亲和洗脱的同时，开始磁珠抗体偶联。首先用1 mL同源洗涤缓冲液洗涤50 µL磁珠。

将磁珠重悬于100微升偶联缓冲液中，并加入适量抗体。然后在室温下孵育磁珠至少10分钟。用偶联缓冲液洗涤磁珠两次，再将磁珠重悬于375微升RIPiT稀释缓冲液中。

将磁珠置于冰上保存，直至进行免疫沉淀。将FLAG亲和洗脱液加入抗体偶联的磁珠中，在4摄氏度下轻柔混匀孵育一至两小时。用磁铁捕获磁珠，并收集15微升上清液用于Western印迹分析。

然后，用等渗洗涤缓冲液洗涤磁珠七次。通过将磁珠重悬于100 µL澄清样品缓冲液中进行变性洗脱，并将悬液置于冰上孵育10分钟。孵育期间，定期轻弹管底以重新混悬磁珠。

将磁珠置于磁力架上捕获，并收集15微升洗脱液用于蛋白质印迹分析。将剩余洗脱液转移至新的1.5毫升离心管中。为提取RNA，在RIPiT洗脱液中加入320微升无RNase的水和400微升苯酚-氯仿-异戊醇溶液。

涡旋混合物，然后在12,000 g离心5分钟。吸取350微升水相至一个新的离心管中。向收集的样品中加入乙酸钠、氯化镁、糖原和乙醇，混合物在-20摄氏度孵育过夜。

第二天，将RNA在4°C条件下以12,000 g离心30分钟，收集沉淀，并用70%乙醇洗涤。乙醇洗涤后，用不含ATP的T4多核苷酸激酶（PNK）处理RNA，然后根据论文中的说明进行苯酚-氯仿纯化。将纯化后的RNA溶于4.5 µL无RN酶的水中。

为了定量RNA产量，根据文稿说明，使用PNK和32P标记的ATP对RNA进行放射性标记。采用低分子量DNA Ladder和20至40个核苷酸的合成寡核苷酸作为大小和数量标准。将标记的RNA在26%尿素-聚丙烯酰胺凝胶上进行分离。

根据实验方案说明将凝胶干燥，并将凝胶暴露于磷光屏直至检测到足够信号。该技术已用于研究外显子连接复合物（exon junction complex，EJC）的相互作用。对RIPiT实验各主要步骤中纯化的蛋白质进行蛋白质印迹（Western blot）分析表明，纯化的EJC同时含有EIF4A3和MAGOH。

阴性对照HNRNPA1在洗脱液中未被检测到。RNA足迹信号的强度与RNA-蛋白质相互作用的量呈正相关。当对经嘌呤霉素处理的细胞进行RIPiT实验时，观察到更强的足迹信号，因为嘌呤霉素可增加EJC在RNA上的占据程度。

为了确保 RIPiT 实验有效，必须通过蛋白质印迹法检测免疫沉淀的效率。在进行深度测序之前，还必须评估 RNA 的含量和质量。2018 年，Singh 实验室成功应用该技术纯化了两种组成上不同的外显子连接复合物亚型，并鉴定了其 RNA 结合模式。

如果研究人员选择使用放射自显影技术检测RNA足迹，则应遵循所有适当的辐射安全程序和规程。