一种用于压片染色体荧光DNA原位杂交的简易方法

本实验的总体目标是利用DNA原位杂交技术将异染色质序列定位到有丝分裂染色体上。首先需解剖三龄果蝇幼虫的大脑或其他感兴趣的组织，第二步是将组织固定在盖玻片上。

接下来，将组织置于盖玻片和载玻片之间压平。为准备染色体杂交，最后一步是将人工合成的短寡核苷酸探针与压平的组织进行杂交。最终，通过荧光显微镜观察，显示染色体上与寡核苷酸探针互补序列的定位。

与现有方法相比，该方法的主要优势在于其简便性。大多数其他染色体和C二杂交方法均需使用大量甲酰胺进行洗涤，而甲酰胺可能价格昂贵且操作繁琐。我们的方法无需甲酰胺洗涤步骤，因此是一种更经济、更清洁且更快速的技术。

尽管该方法为果蝇大脑体细胞染色体上的序列提供了直观的可视化定位途径，但它也可用于不同生物体不同组织中其他类型染色体的序列定位。每制作一张载玻片，需准备四到五个组织样本，但进行脑组织解剖时不宜超过此数量。首先选取游走期三龄幼虫，并将其收集于一滴 1×PBS 中。

选择密度不过大的小瓶进行采集。在解剖镜下，使用超细镊子夹住口钩，另用一对镊子夹住身体长度三分之二处。然后轻轻牵拉口钩，以暴露脑、腹神经节、唾液腺以及消化道部分结构。

接下来，用镊子将脑和腹神经节从其他组织中分离，并转移至塑料培养皿中的一滴 XPBT 液滴内。进行精巢解剖时，需采集雄性三日龄蛹。三日龄蛹的体色呈黄色，眼睛为红色。

翅芽较小的为雄性。用一对镊子夹住腹部顶端靠近胸部区域的蛹体，再用另一对镊子夹住腹部最远端的尖端，然后拉出泪滴状的睾丸。

它们周围附有脂肪体，可轻轻振荡去除。将睾丸的外部组织剥离干净，以免影响后续压片操作，然后将睾丸转移至洁净培养皿中的一滴1×PBST上。待所有组织收集完毕后，用低渗溶液处理，以促进姐妹染色单体的分离。在异染色质区域，将组织转移至一滴0.5%柠檬酸钠溶液中，孵育10分钟。

为达到此效果，不推荐使用秋水仙素，因为它可能导致染色体形态的人工假象。现在，使用超细镊子固定组织。将组织转移至洁净的经 sigma 涂层处理的盖玻片上一个含有新配制的 2.5% PFA 与 45% 醋酸混合液的 20 微升液滴中，用固定液将组织均匀分散，于室温下孵育 4 分钟，随后开始压片操作。首先将一张经多聚赖氨酸包被的载玻片轻轻倒置盖在组织与盖玻片上。

让盖玻片自然粘附在载玻片的底面，不要按压。使用Sigma Coat处理盖玻片有助于确保在移除盖玻片后，压片组织仍保留在载玻片上。然而，偶尔组织可能会附着在盖玻片上。

在此步骤中，我们建议进行重复的组织压片操作。现在将载玻片翻转，放入一张折叠好的厚纸中。然后在稳定的表面上，用拇指紧压盖玻片正上方，垂直用力下压。

按压时不要用力过猛导致盖玻片滑动，否则会抹开组织。通常情况下，用力充分按压可使压片组织中的染色体得到清晰的分散。然而，偶尔可能会遇到染色体质量不一的情况，例如染色体不完整、压碎或断裂。

因此，我们再次建议进行两到三次重复的组织压片实验。将组装好的样品转移至冰块上放置几分钟，然后浸入液氮中，直至液氮停止沸腾或更长时间。在组织解冻前立即取出载玻片，使用新的剃须刀片轻轻弹起盖玻片的一角，从而将其移除。

注意避免划伤组织。然后迅速将玻片放入盛有100%乙醇的考普林瓶中，浸泡至少五分钟。取出玻片，用吸水纸吸去多余的乙醇，注意不要触碰组织，随后让玻片在空气中干燥一小时。

载玻片随后可于干燥容器中保存数周至数月。首先，将每种探针各100纳克加入20微升1.1倍杂交缓冲液中，配制成总体积为22微升、浓度为1倍的杂交缓冲液溶液。然后将混合液用移液器滴加至固定组织上，避免触碰组织，轻柔地加盖盖玻片。

一个未接触组织的小气泡不会造成问题，但若出现更多气泡，则需重新加盖盖玻片。将玻片置于95摄氏度加热块的平整面上，并用铝箔覆盖。等待五分钟，在此期间可准备湿度盒，方法是在吸头盒中加入湿润的纸巾。

然后取下载玻片，小心地用拉伸的帕拉膜包裹，并将其转移至由湿润毛巾构成的湿盒中，在30摄氏度下于湿盒中孵育4小时至过夜。该温度适用于GC含量较低的探针，但对于GC含量较高的探针，可能需要对杂交温度进行一些优化调试。

孵育结束后，小心移除封口膜，然后从盖玻片的一角缓慢揭起。接着将载玻片在0.1 XSSC缓冲液中清洗三次，每次15分钟。清洗过程中用铝箔覆盖容器，以尽量减少光照暴露。

对于长链生物素标记的探针，需先加入链霉亲和素阻断剂并洗涤后再进行后续操作。首先，将组织周围的区域干燥，并在组织上覆盖100 µL封闭液。然后轻轻加盖新的盖玻片，避免产生气泡。

再次用石蜡膜包裹载玻片，然后将载玻片在37摄氏度下孵育30分钟。其次，孵育结束后，移除盖玻片，并用擦拭纸在组织周围吸去多余液体。

然后向组织上加入 100 微升用 SBT 稀释的一比一千的 RUMINE AVADON。接着，按照封闭步骤中的方法，覆盖、包裹并孵育载玻片。最后，小心移除盖玻片并洗涤载玻片。

使用四次 × SSC-T 溶液洗涤三次，随后用 0.1 × SSC 溶液洗涤三次。每次洗涤步骤至少持续五分钟。按照方案继续操作，用吸水纸轻轻吸去多余缓冲液以干燥载玻片，注意不要触碰组织。

然后将切片组织面向上置于避光处 10 至 15 分钟，或直至水分完全蒸发。现在，取 11 微升含 DPI 的 Vector Shield 封片剂进行封片，小心地将未经硅烷处理的盖玻片缓缓放下。若封片剂未完全覆盖所有边缘，可从边缘处补加少量封片剂，并擦去多余液体。

然后用指甲油封固盖玻片，并将载玻片直立存放于暗处，待指甲油干燥，通常需要至少半小时。随后将载玻片于零下20摄氏度保存，最多可保存一周，并应尽快进行组织成像。一组小型商业合成的带有荧光标记的寡核苷酸，以及通过缺口平移法合成的较长生物素标记探针，均被杂交至来自多种不同组织类型的染色体上。

利用所述方法，针对黑腹果蝇359个碱基对卫星重复序列的探针在X染色体上识别出一个大的多兆碱基对区段，而在3号染色体上仅识别出一个小得多的区域。针对应答子卫星序列的较长探针检测到由约700个较低重复拷贝数组成的重复区段。因此，该方法可实现对非常小的卫星区段的可视化。

当低渗溶液处理步骤的持续时间延长至10分钟时，姐妹染色单体的分离程度显著增加。该方法可与其他技术（如抗体染色）结合使用，以回答某些染色质蛋白是否定位于特定序列等科学问题。