利用线虫 Caenorhabditis elegans 对生殖系化学毒性进行综合评估

本实验的总体目标是利用线虫秀丽隐杆线虫（C. elegans）全面评估生殖系化学毒性。首先，通过向混合发育阶段的C. elegans PX481 GFP品系线虫群体中加入稀释的次氯酸钠溶液，实现线虫的同步化。此步骤可产生大量由卵壳保护而免受次氯酸钠影响的胚胎。

第二步是通过让胚胎在无食物的液体中孵化，从而获得同步化的L1幼虫群体。接着，线虫生长至第四幼虫期（L4），在此阶段将其暴露于目标化学物质的液体中，持续65小时。最后一步是通过荧光显微镜观察线虫子宫内胚胎中GFP报告基因的表达情况。

最终，与DMSO对照组相比，GFP阳性胚胎所占的比例反映了被测化合物的抗原性。该技术相较于现有方法（如Rodin模型或细胞培养实验）的主要优势在于，我们能够在完整的动物模型中评估化学物质的致敏性及生殖系毒性，同时进行高通量检测。今天的报告人是博士后研究员Dr.Daniella Perotti。

本实验所用的图形蠕虫已按照配套的实验方案文本中所述方法预先制备。用一到两毫升M9缓冲液冲洗线虫生长培养基或NGM平板，收集GR线虫，并转移至15毫升锥形管中。让GR线虫在15毫升锥形管底部沉降约5到10分钟。随后，在不扰动线虫沉淀物的情况下，移除上清液。

将线虫沉淀转移至两到四个微量离心管中，每管加入一毫升稀释的次氯酸钠溶液。室温孵育两到三分钟。在体视显微镜下监测反应进程，以确认所有线虫均已死亡。

漂白时间不得超过五分钟，否则胚胎可能死亡。在3000 RPM条件下，通过离心一分钟收集线虫。

移除上清液，并加入一毫升无菌M9培养基以中和反应。确保经过漂白处理后的线虫所接触的所有材料均为无菌。用M9培养基将线虫洗涤两次。

移去上清液，加入 100 至 200 微升 M9 培养基。使用玻璃巴斯德吸管，取一滴线虫 M9 混悬液滴加到无菌 NGM 平板上，于 20 摄氏度孵育至少 24 小时，使胚胎在无食物条件下孵化。幼虫的生长将停滞在 L1 期，实现两步同步化。

使用漂白和L-色氨酸饥饿处理是因为获得高度同步化的幼虫群体至关重要，以最大化可用于暴露实验的L4幼虫数量。在建立同步化的L1幼虫群体后一天，从干净的NGM平板上收集L1幼虫。用一到两毫升M9缓冲液冲洗平板，并将L1幼虫转移至15毫升锥形管中。

让死亡的成虫在15毫升锥形管底部沉淀约五分钟。收集含有L1幼虫的上清液至新的15毫升锥形管中。在2,600 RPM条件下离心两分钟，使虫体沉淀。

去除上清液，保留约 500 µL。通过计数 10 µL 液滴中的线虫数量，确定 M9 溶液中线虫的浓度。使用体视显微镜至少计数五个液滴。

用M9缓冲液将线虫浓度调整为每微升20至25只，然后取50微升线虫M9混合液加入已铺有OP50大肠杆菌的NGM平板中。在15摄氏度下培养65小时，使同步化的L1期群体发育至L4期。该筛选实验采用一种CL对抗菌株，该菌株含有荧光转录报告系统，用于检测生殖系紊乱及胚胎非整倍体的诱导情况。

用一到两毫升M九缓冲液冲洗透明的NGM平板，收集其中的L四幼虫，并将其转移至一个15毫升的圆锥形离心管中。让L四线虫在15毫升圆锥形离心管底部沉降约5到10分钟。随后在不扰动虫体沉淀的前提下，移除上清液。

加入三到五毫升 M9 液体，并通过计数 10 微升液滴中的线虫数量来确定 M9 溶液中线虫的浓度。使用体视显微镜对每个样品至少计数五个液滴。将线虫用 M9 液体重悬，调整浓度至每毫升含一个线虫。

用M9培养基将先前制备的OP 50细菌稀释十倍。确保重悬的细菌达到室温，因为较低温度会影响线虫发育。首先使用多通道移液器，向每孔加入100微升线虫M9混合液至一个2毫升深孔圆底96孔板的各孔中。最后，向每孔再加入400微升稀释后的OP 50细菌。

每个孔中含有100条线虫，体积为500 µL。向目标孔中加入0.5 µL测试化合物，使终浓度达到100 µmol/L。在秀丽隐杆线虫（C. elegans）的化学筛选中，常用该浓度；同时以终浓度0.1%的乙醇或DMSO溶剂作为对照，作为阳性对照。

使用 100 微摩尔无共溶剂。使用粘性封板膜密封板孔。务必密封良好，以防止孔间交叉污染。

用铝箔包裹培养板。将培养板转移至适当温度的摇床中，振荡适当时间。在化学物质暴露结束后，线虫的生长会受到温度影响，因此需将室温维持在约20摄氏度。

使用多通道移液器后，将96孔板静置10至15分钟，使成虫沉降到孔板底部。小心吸除每孔中的350 µL M9培养基，注意不要扰动孔底的线虫。用1 mL M9培养基洗涤线虫，然后再次将孔板静置10至15分钟，使成虫沉降到孔底。

从每个孔中移除一毫升 M9 培养基，操作时需非常小心，避免扰动平板底部的线虫。用剩余的 M9 培养基重悬线虫。从 96 孔板中吸取 100 微升线虫与 M9 培养基的混合液，加入到黑色壁透明底的 384 孔板的孔中。

使用来自4块96孔板的线虫重复此过程，直至384孔板的所有孔均加样完毕。为提高图像采集过程中自动对焦的效率和速度，所有孔中的液体体积必须保持一致。接下来，向每个孔中加入1 µL的lale，让线虫孵育约30分钟。

Lale 作为一种乙酰胆碱受体激动剂，可使蠕虫麻痹。将培养板转移至具备自动成像功能的宽视野高内涵显微镜。根据制造商的说明，使用高内涵图像采集与分析软件。选择四倍物镜，每个样本采集一张图像。

将GFP成像参数调整为曝光时间45毫秒，图像分辨率为2160 × 2160。开始图像采集，将暴露的线虫直接在384孔板上进行成像。对每个孔中至少含有一个GFP阳性胚胎的线虫数量进行计数，并除以该孔中线虫的总数，进行归一化处理，如下图所示。

暴露于微管毒物 no-code AOL 等化学试剂后，与 DMSO 对照组相比，表达 GFP 的胚胎比例显著升高。GFP 阳性胚胎的荧光强度明显强于其他胚胎中观察到的微弱背景荧光，以及动物肠道中观察到的自发荧光。红色箭头指示在经 no-code AOL 处理的线虫子宫内清晰可见的 GFP 阳性胚胎。

采用此方法后，还可进行其他实验操作，例如对线虫进行DNA染色，以更详细地观察化学品对生殖系的影响。该技术可使毒理学领域的研究人员快速评估化学品的生殖毒性和生殖系毒性。