生成和使用人诱导多能干细胞来源的神经前体细胞用于神经系统疾病研究的指南

本实验的总体目标是利用人诱导性多能干细胞（hiPSCs）生成神经前体细胞（NPCs），作为研究神经系统疾病相关细胞与分子机制的平台。该目标的实现首先通过使用双SMAD抑制剂将hiPSCs分化为神经玫瑰花环结构；第二步是收获这些神经玫瑰花环结构，并使其发育为可扩增的NPC群体。

接下来进行慢病毒转导，并采用离心感染法以提高转导效率，用于调控基因表达。最后一步是将神经前体细胞（NPCs）在悬浮培养中生长，使其自发形成神经球。

最终，该平台可用于检测多种细胞表型。例如，测量基因操作对神经元迁移的影响。尽管该方法可为细胞迁移等机制提供见解。

它还可用于研究其他生物过程，如复制、氧化应激、细胞凋亡和神经突生长。人诱导性多能干细胞或高纯度多能干细胞的分化可形成可见的神经玫瑰花结，其特征为具有顶端-基底极性的神经上皮细胞组成的圆形簇集，可用于在第14天对神经玫瑰花结进行酶法筛选。吸去贴壁胚状体或EBs中的培养基，每六孔板孔加入1毫升神经玫瑰花结筛选试剂，在37°C下孵育1小时。

一小时后，使用P-1000移液器小心地从每个孔中移除酶溶液，并向每孔加入一毫升D-M-E-M-F12培养基。为洗涤玫瑰花结结构，收集每孔中的一毫升D-M-E-M-F12培养基，迅速将其重新排回孔内，从而将玫瑰花结从培养板上分离下来。

将玫瑰花环结构收集到一个离心管中。再用移液器吸取一毫升 D-M-E-M-F 12 培养基，迅速排入同一孔中，以解离残留的玫瑰花环结构。操作时不要吹打，尽量避免破坏玫瑰花环聚集体。将神经玫瑰花环结构收集到同一个离心管中。

如果收集完所有神经玫瑰花环后，它们仍未轻易脱落，可添加更多的酶，并重复此步骤。将 Falcon 管在 300 G 条件下离心 3 分钟。吸除上清液，重悬细胞。

将类胚体悬浮于2 mL神经前体细胞培养基中。将细胞转移至经多聚-L-鸟氨酸包被的六孔板中，在37°C条件下培养一周。本实验室中，神经前体细胞（NPCs）在Matrigel包被的培养板上生长，每两天换液一次，并维持在极高的细胞密度下。

为分离NPCs，首先吸除培养基，然后每六孔板孔中加入1毫升预热的Accutase，于37摄氏度孵育10至15分钟。轻柔地将脱落的细胞转移至含有D-M-E-M-F12培养基的15毫升离心管中，尽量减少机械应力。在酶解过程中不要吹打细胞。通过以1000 ×g离心5分钟使细胞成团，离心后吸除上清液，并重悬NPCs。

每六孔板原有的每个孔，预计在重悬并计数后，每毫升 NPC 培养基中可获得 500 万至 1000 万个细胞。为维持 NPCs 的培养，每六孔板每孔接种约 100 万至 200 万个细胞。神经球形成的效率因实验和细胞系而异，但通常在每孔非黏附六孔板中接种 20 万至 100 万个细胞时效果最佳；若出现细胞聚团，应减少接种细胞数量。理想情况下，应在传代后一至两天内完成接种。

应使用慢病毒或逆转录病毒载体对NP神经前体细胞进行转导，以提高转染细胞的比例。采用旋转感染法。吸出每孔中的培养基，并替换为相应过表达或对照用的慢病毒或逆转录病毒，按所需感染复数进行滴定并稀释。

在NPC培养基中，每六孔板每孔使用1.5毫升，在平板离心机中以1000 ×g、室温离心1小时。离心后，将培养板放回培养箱中，以减少细胞死亡。在离心感染后8小时内更换培养基。

开始此操作时，先用神经前体细胞培养基洗涤一次 NPC 来源的神经球，以去除细胞碎片。将培养板倾斜 45 度角，使神经球沉降，然后尽可能移除培养基，注意不要吸走神经球。随后更换新鲜培养基。

接下来，在显微镜下使用 P200 移液器手动挑选由 NPC 衍生的神经球，并将每个神经球转移至已包被基质胶的 96 孔板的各个孔中。为减少实验结果的变异性，应挑选大小相近的神经球。向每孔 96 孔板中的神经球加入额外的 0.5 毫克基质胶，该基质胶需用冷的 NPC 培养基稀释。

使用移液器吸头手动将每个神经球居中放置于孔板的中央位置。让神经球迁移48小时。用所需的免疫组织化学标记物固定并染色细胞后，使用Forex显微镜物镜完整拍摄神经球。使用ImageJ软件测量放射状迁移距离。

使用自由选择工具手动描记迁移最远细胞的边缘。确保在“分析”选项卡下的“设置测量”窗口中已勾选面积选项。然后使用测量功能计算所得图形的面积。

利用面积测量值及圆的面积公式，以相同方法确定外半径，方法为描记原始神经球的边缘。测量面积并计算内半径。通过外半径与内半径之差计算总径向迁移距离。

这些图像展示了高纯度 PSC 神经分化过程的各个阶段，从高纯度 PSCs 形成拟胚体、神经玫瑰花环结构、神经前体细胞（NPCs），最终分化为神经元。经验证，NPCs 在大多数细胞中表达 NPC 标记物 nestin 以及神经干细胞转录因子 SOX2。在所有 NPC 群体中均可观察到 βIII 微管蛋白染色。此外，NPCs 还表达神经干细胞转录因子 Pax6 以及前脑前体细胞标记物 Foxg1。

TBR2阳性，但无中脑标记物（如LMX1A和FOXA2）的神经前体细胞可分化为70%至80%的βIII微管蛋白阳性神经元（绿色显示）以及20%至30%的胶质纤维酸性蛋白阳性星形胶质细胞（红色显示）。高质量的多能干细胞来源的神经前体细胞在大多数细胞中表达Nestin和SOX2，而低质量的神经前体细胞则出现SOX2阴性和Nestin阴性细胞的成片区域。由高质量神经前体细胞分化的4周龄神经元表达MAP2AB和βIII微管蛋白。

在使用高滴度的慢病毒或逆转录病毒载体成功转导后，超过80%的细胞被荧光报告基因标记。该载体中包含的元件可促进神经球的生成，从而产生大小相对均一的神经球群体，这些神经球在培养中可保持健康状态约一周时间。

通过定期换液，健康的神经球可表现出显著的神经球迁移现象，如这些明场图像所示，分别为在Matrigel中培养48小时前后的情况。该技术为精神分裂症领域的研究人员探索由人诱导多能干细胞衍生的神经前体细胞中的神经迁移提供了途径。请注意，使用逆转录病毒可能存在潜在危险，当可能存在病毒时，所有组织培养操作均应在生物安全二级及以上条件下进行。