快速检测人类神经前体细胞（NPCs）中的神经发育表型

本方案的总体目标是以快速且可重复的方式表征人神经前体细胞的早期脑发育过程，并明确重要细胞外因子在调控这些过程中的作用。该方法有助于回答神经精神疾病和神经发育障碍领域的重要问题，例如：所有受影响个体是否具有相同的细胞异常，或者相反，是否每个人表现出特定于个体的功能障碍？本方案的主要优势在于其快速、高度可重复且易于实施。

尽管该方法可用于研究神经发育障碍，也可用于研究神经退行性疾病和神经精神疾病，如阿尔茨海默病和抑郁症。由于某些技术涉及将细胞从一个培养皿转移至另一个培养皿，或需要进行形态学分析，因此有必要通过视觉演示来展示其中部分方法，以达到最佳传达效果。要分离人神经前体细胞，需吸除培养基，并用1×磷酸盐缓冲液洗涤细胞一次。

吸去磷酸盐缓冲液，向含有神经前体细胞的孔中加入500微升1倍细胞解离溶液。然后在37摄氏度下孵育培养板10分钟。接着使用P1000移液器加入500微升室温保存的磷酸盐缓冲液，以洗涤并去除细胞。

然后，将磷酸盐缓冲液中的细胞转移至一个15毫升的锥形管中。再用1毫升磷酸盐缓冲液洗涤一次培养孔，并将洗涤液转移至该管中。接着，以300 ×g离心5分钟，使细胞形成沉淀。

然后，弃去上清液，将沉淀物重悬于1至5毫升预热的DMEM/F12培养基中。每孔接种100,000个细胞，每个样本设三个复孔，使用24孔板进行培养。46小时后，向培养基中加入氚标记的胸腺嘧啶核苷，并在37°C下孵育2小时。

然后，吸除培养基后，加入300微升预热的0.25%胰蛋白酶EDTA，于37摄氏度孵育20分钟，以解离细胞并释放DNA。接着，开启细胞收集器和泵，将滤纸放入细胞收集器中。

将细胞收集器的收集管持续放入一个空的空白托盘中。然后，按下预洗键以润湿滤纸。将收集管放入样品孔中，然后开始运行。

使用热光源烘干滤纸，并将相应的样品瓶排列在托盘上。将滤纸片打孔至样品瓶中，然后向每个样品瓶中加入 2 毫升液体闪烁液。在使用闪烁计数仪前，将样品瓶在仪器中孵育 1 小时，以获取每分钟计数（CPM），该数值反映 DNA 的活跃合成水平。

在35毫米培养皿中接种500,000个细胞。然后，将培养皿向各个方向轻轻晃动，使细胞均匀分布。接着，在37°C条件下孵育细胞46小时。

然后，向培养物中加入终浓度为5 mM的EdU，每毫升培养物加2 µL，孵育2小时。接着，将细胞解离并离心成团。向细胞沉淀中加入3 mL含或不含生长因子或药物的30%扩增培养基。

将1毫升细胞悬液接种到预先包被的培养皿中，在37摄氏度下孵育2小时。为研究培养中的神经前体细胞数量，在培养两天后，标记并准备好微量离心管。然后吸出孔中的培养基，加入200微升1X细胞解离溶液，在37摄氏度下孵育15分钟。

细胞脱离后，向每个孔中加入300微升1×磷酸盐缓冲液。使用P1000移液器反复吹打细胞溶液数次，使细胞从培养板上完全脱离。然后将细胞悬液转移至预先准备好的1.5毫升离心管中，并将离心管上下颠倒2至3次。

用移液器从管中点位置吸取50微升细胞，加入至0.5毫升离心管中的台盼蓝溶液中。然后使用血细胞计数板进行细胞计数。为形成神经球，将1毫升100%扩增培养基加入无任何包被基质的35毫米培养皿中。

然后，向每个培养板中加入一百万个神经前体细胞，并在37摄氏度下孵育48至96小时。为准备用于神经球迁移的培养板，将ECM模拟凝胶等分试样溶解于6毫升30%扩增培养基中。在六孔板的单个孔中加入1毫升含30%扩增培养基的ECM模拟凝胶。

然后，将培养板在37摄氏度下孵育30分钟。接种神经球时，使用移液器从35毫米培养皿中收集含有细胞的培养基，并转移至一个锥形管中。随后，在100 ×g 条件下离心锥形管，使神经球沉淀。

然后，将沉淀重悬于1至3毫升预热的30%扩增培养基中。接着，用移液器将200微升重悬的神经球加入六孔板中，六孔板内含有ECM模拟凝胶和30%扩增培养基，轻轻摇动培养板。随后，将培养板置于37摄氏度孵育48小时。

用含30%扩张培养基的ECM模拟凝胶重悬细胞，然后使用4%多聚甲醛固定细胞30分钟。为分析神经球，采用10倍放大倍数的相差显微镜设置采集图像。使用NIH ImageJ软件测量神经球的平均迁移距离。

在 ImageJ 中，使用手绘线条工具勾勒神经球的外轮廓。然后，使用测量功能计算所勾勒区域的面积，并勾勒球体内内部细胞团的区域。用神经球总面积减去内部细胞团面积，以量化平均迁移距离。

通过免疫细胞化学染色研究第3代神经前体细胞中细胞骨架蛋白以及SOX2、PAX6和巢蛋白（nestin）等转录因子的表达情况。随后，采集相差显微图像以识别具有神经突的细胞。根据图像，将突起长度等于或长于两个细胞体的细胞视为具有神经突的细胞，而突起长度短于两个细胞体的细胞则不视为具有神经突的细胞。

为确认神经球的形成，采集了相差显微图像，结果显示在72小时时间点收集的神经球大小介于80微米至120微米之间，因此可用于迁移实验。为明确增殖能力，将神经前体细胞在对照或成纤维细胞生长因子条件下培养，并对EdU的存在进行染色。相差荧光图像显示，经成纤维细胞生长因子处理的细胞中处于S期的细胞比例更高，这通过EdU染色得以证实。

接下来，为了检测神经突的生长情况，将细胞在对照条件下进行检测，并与PACAP处理组进行比较。采集了相差图像，显示在PACAP处理下具有神经突的细胞数量增加。随后，为了研究神经球的迁移，用PACAP神经肽处理细胞。

获得的相差图像显示，与对照组相比，神经球的迁移增加。本方案包含多种技术和检测方法，每种方法所需时间各不相同。掌握之后，平均每项检测的建立需要两到三小时，分析则需要30分钟至三小时。

在进行这些操作时，至关重要的是确保使用高质量的神经前体细胞，并且这些细胞在除神经球形成实验以外的所有条件下均被完全解离并均匀分布。完成这些操作后，可进一步开展其他分析，包括蛋白质印迹（Western blotting）、定量逆转录 PCR（QRT-PCR）、转录组学、蛋白质组学和代谢组学，以阐明其潜在的作用机制。感谢观看，祝您的实验顺利成功。