利用3D打印技术制备工程化血管皮瓣

本方案使研究人员能够在完全工程化且可植入的皮瓣中生成分级血管网络，为研究血管在体内整合过程中的行为开辟了新途径。该技术结合了两种3D打印技术的灵活性，可在微米和介观尺度上创建并组装血管，并能通过显微外科手术直接与宿主血管进行吻合。完全工程化的带血管皮瓣不仅可用于治疗大面积组织缺损，还可为研究组织发育与整合提供平台。

可将所提出的方法拓展用于研究组织特异性细胞的整合，以及评估不同生物墨水和支持材料的使用。首先，在BVOH模具中加入30 µL聚合物溶液。以100 × g离心2分钟，随后再向模具中补充20 µL聚合物溶液，以确保模具完全填充。

将装有材料的模具置于零下80摄氏度条件下冷冻至少30分钟，以确保所有聚合物溶液完全冻结。通过冷冻干燥过夜的方式去除模具中的溶剂。为去除牺牲性模具材料，将冷冻干燥后的模具转移至5升的去离子水浴中，在温和搅拌条件下进行处理。

当水浴变浑浊时，需更换其中的水。待所有BVOH完全溶解后，将支架风干，并在使用前储存于真空干燥箱中。使用正向置换移液器，将约4毫升已制备并压实的支撑材料转移至12孔板的每个孔中。

将孔板轻敲于硬质表面，使支撑材料在孔内均匀分布。制备含有200万HAMEC-ZsGreen细胞和600万牙髓干细胞的悬浮液，总体积为10毫升内皮细胞培养基。将细胞悬浮液以200 × g离心4分钟，获得细胞沉淀，随后吸除上清培养基，并将细胞沉淀重悬于1毫升rhCollMA生物墨水（bioink）中，得到总细胞浓度为每1毫升生物墨水含800万细胞的生物墨水悬液。

将内径为0.22毫米的针头安装到3毫升棕色打印 cartridge 上，并将 cartridge 置于50毫升锥形管中。使用正向置换移液器从顶部将1毫升细胞-生物墨水混合物转移至打印 cartridge 中，以减少气泡产生。将打印 cartridge 安装至生物打印机的相应工具中。

绘制一个包含中心圆形通道的 4 毫米方形的二维图案，该圆形通道直径为 2 毫米。将该草图沿高度方向拉伸 4 毫米，得到一个带有中心通道的 4 毫米立方体。将此对象导出为 STL 文件。

将12孔板STL模板导入生物打印机切片软件的实体建模选项卡中，并放置在虚拟打印平台的指定区域。将立方体形状的STL文件导入生物打印机切片软件的实体建模选项卡中。在对象属性部分，单击使用外部切片器复选框，然后单击配置切片器。

在弹出窗口中，选择直线型填充图案，并在填充密度中输入 30%，然后点击确认。点击立方体，使用鼠标将其移动，将立方体形状的副本放置在每个目标虚拟孔中。在生物打印机切片软件的材料选项卡中，点击“添加材料”按钮，为 rhCollMA 生物墨水创建新的材料参数设置。

选择打印的材料设置。在相应的输入框中，压力设置为 2 psi，速度设置为 20 毫米每秒。将线宽和线高值设为 0.24 毫米，加速度值设为 400 毫米每平方秒。

在实体建模选项卡中，单击立方体对象，然后单击材质部分的 rhCollMA 材质，将其分配给立方体形状。在生物组装选项卡中，单击“发送打印任务”按钮，将打印任务发送至生物打印机。将装有细胞生物墨水的打印 cartridge 装载到基于 3D 挤出的生物打印机的 3 毫升常温气动分配工具中。

在生物打印机界面屏幕的“控制加热或冷却”选项卡下，单击“冷却”按钮，将打印平台温度设置为 4 摄氏度。将载有支撑浴的培养板装载到打印机平台上。在生物打印机界面屏幕的“打印”选项卡中，单击打印任务，然后依次单击“开始”和“GO”，以启动打印任务。

打印完成后，将孔板置于波长为405纳米、光强为3毫瓦/平方厘米的光源下照射30秒，以启动rhCollMA生物墨水的交联。交联后，将孔板在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育至少20分钟，直至所有支撑浴完全融化。轻柔吸除液化的支撑浴，并更换为内皮细胞培养基。

将构建物置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。在去除生物打印微血管网络的支撑材料后，立即将纤维连接蛋白包被的PLLA:PLGA血管支架放置于生物打印结构旁，并将血管支架插入生物打印结构的主通道中。

将组装好的构建体在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育两天。制备浓度为每毫升1000万个细胞的表达tdTomato的人类脂肪微血管内皮细胞悬液。在疏水性表面放置20微升该细胞悬液的液滴。

轻轻将血管支架置于液滴上方，使支架一端的管腔与细胞液滴接触。从支架的另一端吸液，使细胞悬液充满支架管腔。将已接种细胞的支架放入微量离心管中，并置于湿润培养箱内的旋转仪上孵育60分钟。

最后，将支架转移至12孔板中，并加入2毫升内皮细胞培养基。此处显示的是血管支架内皮化后第4天拍摄的代表性工程化皮瓣的侧面图像。生物打印的微血管结构显示为绿色，而内皮层显示为红色。

代表性图像显示了生物打印的血管系统与内皮层之间的吻合情况。图中展示了孵育七天后平滑肌肌动蛋白、细胞核以及内皮细胞的免疫染色结果。该代表性图像显示了工程化皮瓣与大鼠股动脉在夹闭移除前及夹闭移除后已完成的吻合情况。

该技术可用于研究3D打印血管在体内的成熟与整合情况，并监测植入物在后肢的灌注，以评估其用于治疗组织缺损的潜力与安全性。