使用同轴喷嘴进行多能干细胞的海藻酸盐封装

本实验的总体目标是安全、有效地将干细胞包埋于海藻酸盐水凝胶微胶囊中，并在胶囊内进行培养，以控制细胞聚集状态和微环境。该过程首先将过滤后的干细胞悬液与海藻酸钠溶液混合，随后将混合液转移至注射器中，并在注射器上安装同轴喷嘴，再将注射器置于注射泵上。接着，通过氮气共流推动细胞悬液挤出形成液滴，随后收集液滴并加入氯化钙溶液进行交联固化。

随后，将胶囊用聚-L-赖氨酸处理以防止细胞泄漏，并用EDTA处理以使胶囊内部液化，然后在旋转振荡条件下培养包封的细胞。最后，通过EDTA处理及物理破坏膜结构从胶囊中收集细胞。最终，海藻酸盐包封多能干细胞可防止细胞过度聚集，并限制悬浮培养过程中细胞所受到的剪切应力。

该方法有助于解答生物与生物医学领域的关键问题，例如细胞移植的大规模扩增以及干细胞微环境的研究。开始细胞包封操作时，按照文本方案所述，通过在160 × g 条件下离心3分钟收集细胞。用Resus重悬诱导性多能干细胞（IPS细胞）沉淀，加入Hanks缓冲盐溶液悬浮细胞，重复洗涤三次：每次均在Resus中重悬细胞，加入Hanks缓冲盐溶液，随后离心。

将细胞悬液通过40微米的细胞滤网过滤，以去除可能堵塞喷嘴的大块聚集体。接着，将2毫升过滤后的细胞悬液与3毫升5%海藻酸钠溶液混合。最终获得5毫升含3%海藻酸钠的细胞悬液，细胞密度需大于每毫升100万个细胞。

将细胞悬液收集到5毫升注射器中后，在注射器上安装同轴喷嘴，并将其置于注射泵上；通过同轴喷嘴的外针通入氮气流，同时通过内针挤出细胞悬液。将形成的液滴收集至250毫升0.5%氯化钙溶液中，在60至90 RPM的搅拌条件下静置10至20分钟以完成交联。用大量缓冲盐水洗涤后，收集所得微囊作为裸胶囊使用；如需处理，则将海藻酸钙微囊在0.05%（质量/体积）的溶液中孵育。

在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，将聚-L-赖氨酸溶液振荡孵育五分钟。收集胶囊至离心管中，用大量缓冲盐水洗涤，然后在含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM中孵育。为中和其表面的电荷，可将所得胶囊作为包被胶囊用于制备中空胶囊。

将胶囊置于含有10毫摩尔EDTA的缓冲盐溶液中孵育5分钟。经EDTA处理的胶囊用作中空胶囊。将包封的细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，以75转/分钟振荡孵育10天；孵育结束后，收集胶囊并将其在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，于10毫摩尔EDTA溶液中继续孵育10分钟。

通过离心（1000 × g，3 分钟）收集未经多聚赖氨酸处理的藻酸盐胶囊中的细胞。若藻酸盐胶囊经过多聚赖氨酸处理，则用连接针头的注射器反复吹打约 10 次以破坏藻酸盐-多聚赖氨酸膜。针头直径应小于胶囊尺寸，本实验中使用 25 号针头。

在5分钟内以1000至5,000 ×g离心后，严格从破裂的海藻酸盐-聚-L-赖氨酸膜中收集细胞沉淀。如果从细胞中收集mRNA样本，需注意残留的海藻酸盐-聚-L-赖氨酸膜可能会阻碍mRNA的纯化，这一点可通过高速摄像观察到。排出的海藻酸盐溶液在排出后立即形成球形。如果悬浮液以低于每分钟1升的氮气流速排出，则液滴的大小均匀。

然而，如果氮气流速高于每分钟一升，液滴会破裂，导致液滴尺寸不均一。因此，使用该方法难以制备小于500微米的液滴。在凝胶化过程中，海藻酸钠液滴在氯化钙溶液中形成球形的海藻酸钙微胶囊。

然而，如果海藻酸钠浓度过低，会导致胶囊出现不规则、非球形和不均匀的形态，在编码过程中会产生问题。即使海藻酸钠浓度不足，也可通过提高钙离子浓度来形成球形胶囊。但是，用于包封的氯化钙浓度以约 50 毫摩尔为宜，因为过高的氯化钙浓度会降低细胞生长和细胞活性。

细胞可以在胶囊内生长，但若无海藻酸聚-L-赖氨酸涂层，胶囊可能会发生细胞泄漏。对于小鼠诱导多能干细胞（iPS细胞），在每个海藻酸钙胶囊中，细胞会形成盘状聚集体，而在每个中空胶囊中，细胞则会聚集在一起形成单个球形聚集体。观看本视频后，您应能够充分理解如何将细胞包封并培养以实现尺寸控制。

无需任何特殊设备，无需有机吸附剂即可捕获氢气。