微流控法制备负载人多能干细胞球体的核-壳微胶囊
2021年10月13日
本文介绍了利用同轴流动聚焦装置包封人多能干细胞（hPSCs）的方法。我们证明，该微流控包封技术可高效生成hPSC细胞球。
该区域因能形成具有更高多能性和分化潜能的三维人多能干细胞培养体系而备受关注。我们描述了一种包封策略，可实现人多能干细胞球体的可重复形成。包封后，这些干细胞球体可用于培养，既可在多孔板中进行，也可在搅拌式生物反应器中进行。
我们的包封策略旨在优化类球体形成的存活率和高效率。包封后的类球体能够免受搅拌或摇动过程中产生的剪切力或机械能的影响。干细胞来源的细胞治疗的发展，在一定程度上依赖于以可扩展、高效且具有成本效益的方式生成目标细胞产品的能力。
此处所述的包封技术代表了朝这一方向迈进的一步。该包封技术可能适用于从其他细胞到其他多能干细胞等多种细胞类型的三维培养。首先通过混合4.8克35千道尔顿的聚乙二醇（PEG）、10.2毫升密度梯度培养基和19.8毫升DMEM/F-12培养基，制备30毫升的两倍核心储备液。
然后使用 0.22 微米注射器滤器过滤该核心溶液。接着，通过混合 48.5 毫升矿物油和 1.5 毫升表面活性剂，制备含 3% 表面活性剂的 50 毫升矿物油溶液。然后将溶液经 0.22 微米注射器滤器过滤以实现灭菌。
接下来，按照文稿中的描述，配制 1 摩尔的 DTT、1 摩尔的 TEA 和 1% 的 PF127 溶液。然后通过将 4.5 毫升矿物油与 3% 表面活性剂和 300 微升 1 摩尔 DTT 混合，制备交联剂乳液。将该溶液涡旋振荡 2 分钟后，在 20 摄氏度的超声水浴中超声处理 45 至 60 分钟，并将其装入带有 27 号针头的 5 毫升注射器中。
接下来，通过将含有0.5%表面活性剂的矿物油加入带有27号针头的5毫升注射器中，制备屏蔽油溶液。为制备壳层溶液，将32毫克PEG4马来酰亚胺加入400微升DPBS中，然后加入6微升1摩尔的三乙胺（TEA）。
将溶液涡旋振荡2分钟，然后通过离心过滤装置进行离心。将溶液避光置于摇床上30分钟，随后装入带有27号针头的1毫升注射器中。最后，通过将2000万个hPSCs重悬于200微升培养基中，并加入30微升1% PF127和200微升2X核心溶液，制备最终的核心溶液。
将一个小的搅拌子插入1毫升注射器中。然后，使用27号针头将含有核心溶液的细胞加载到注射器中。首先，将键合好的PDMS液滴装置、4段20厘米长的进样微管、1段5厘米长的进样微管、1段10厘米长的出样管以及6段0.5厘米长的连接管置于杀菌光源下照射30分钟进行灭菌。
现在使用镊子将4根20厘米长的进样微管分别插入外壳、油相、交联剂乳液和解离装置的进样口。然后，将微管的另一端插入装有相应溶液的注射器针头中。同时，用一根5厘米长的微管连接微流控装置的内相进样口和解离装置的出口。
将一根出口管插入流体出口端口，并将另一端放入收集容器中。接着，将装置放置在显微镜载物台上，并固定管路以避免任何移动。调整显微镜并对准装置喷嘴，聚焦以观察流体流动情况。
将每支注射器分别放置在不同的注射泵上，并妥善固定。根据制造商的操作规程，将各泵的流速设置为文稿中所述的流速，然后启动所有泵的流动。等待每种流体进入芯片并充满通道，同时排出残留的空气。
当类胚体形成稳定后，将收集管的另一端放入含有5毫升mTeSR培养基的新锥形管中。收集到足够数量的类胚体后，将其孵育10分钟。位于油相中的类胚体会处于管子上部，轻轻敲击管壁后，它们会沉降至管底。
为回收微胶囊，首先从收集管中去除油相。随后，将微胶囊置于孔径为100微米的细胞筛网上，并用大量培养基冲洗筛网。将滤膜倒置在6孔培养板的一个孔上方，通过滤膜加入2毫升培养基，以收集微胶囊。
将干细胞微囊置于6孔培养板中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。每隔一天更换培养基：用细胞筛滤器收集微囊，用过量培养基洗涤，然后重悬于6孔板的新孔中，每孔加入2毫升培养基。进行活力检测时，向2毫升无菌DPBS中加入4微升2微摩尔的碘化丙啶同型二聚体-1（Ethidium Homodimer-1）溶液和1微升4微摩尔的钙黄绿素-AM（Calcein-AM）溶液。
涡旋以确保充分混匀。用细胞筛收集约100个微胶囊，并用无菌DPBS冲洗，使培养基从胶囊中扩散出来。再次收集至12孔培养板中，加入1毫升含有Ethidium Homodimer-1和钙黄绿素AM的预配溶液，在37摄氏度孵育20分钟。
在荧光显微镜下观察细胞。利用微流控液滴生成技术制备的优质和次优微胶囊，其胶囊形态随壳层中 PEG4-Maleimide 含量的不同而存在差异。表面光滑且边缘明亮的胶囊具有理想的机械完整性。
微球在胶囊中心聚集表明核心为水相，且微球可自由移动。荧光环状结构表明存在水凝胶外壳，并用于测定外壳厚度。H9细胞包封后6小时的活/死染色显示，在包封过程中细胞活力通常超过95%。
通过比较包封与未包封类球体的生长速率和分化潜能，确定包封过程对人多能干细胞（hPSCs）无不良影响。请注意，建立核心壳层与油相流之间的最佳流速比至关重要。
如果不这样做，可能导致胶囊机械强度不足，在操作过程中发生破裂。需要指出的是，该包封技术适用于除人类多能干细胞以外的其他细胞类型。我们已采用类似策略，主要针对癌细胞系和间充质干细胞进行了包封，其中部分为假设性研究。
目前，我们的团队正在开发新一代微捕获装置。这些微捕获装置具有生物活性，可负载多种因子，用于干细胞的包封分化。
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概述
本文介绍了一种利用同轴流体聚焦装置对人类多能干细胞（hPSCs）进行包封的策略。该方法能够高效地形成适用于多种培养环境的人类多能干细胞球状体。
关键研究组成部分
科学领域
- 干细胞生物学
- 微流控技术
- 三维细胞培养
背景
- 在三维培养条件下，人类多能干细胞具有增强的多能性和分化潜能。
- 包封可保护干细胞球体免受机械应力损伤。
- 高效的球体形成对于细胞治疗开发至关重要。
- 需要可规模化且成本效益高的细胞产品制备方法。
研究目的
- 建立一种可重复的hPSCs包封策略。
- 提高类球体形成的存活率和效率。
- 便于在多孔板或搅拌式生物反应器中进行培养。
使用的方法
- 用于包封的同轴流聚焦装置。
- 用于类球体形成的微流控技术。
- 培养过程中机械保护作用的评估。
- 优化包封参数以提高实验效果。
主要结果
- 通过包封实现人多能干细胞（hPSC）类球体的成功形成。
- 包封后的类球体对剪切力表现出较强的耐受性。
- 该方法在类球体生成中表现出高效率。
- 在细胞治疗的规模化应用方面具有潜力。
结论
- 该包封策略对人多能干细胞球体的形成具有良好的效果。
- 微流控包封技术可提高细胞存活率和包封效率。
- 该方法有助于可规模化细胞治疗技术的开发。
常见问题
行业重要性概述
人多能干细胞（hPSC）类球体的微流控封装技术解决了早期细胞治疗和再生医学研发中可扩展、可重复的三维细胞培养所面临的关键挑战。该技术通过保护细胞活力并实现高通量类球体生成，提高了细胞分化结果预测的可靠性，并支持研发管线的稳健推进。该技术整合到发现阶段及临床前工作流程中，可作为靶点验证和转化研究的可重复使用平台。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可在三维系统中实现人多能干细胞（hPSC）类球体的稳健形成，用于功能靶点的研究分析。
- 在包封过程中维持细胞高存活率和多能性，支持生物学风险的降低。
- 有助于提高在分化及谱系定向研究中的预测可靠性。
筛选与检测方法开发
- 提供标准化、可重复的微胶囊，适用于下游高内涵筛选。
- 提供定量的活力和形态学输出，用于检测优化。
- 实现均一球形体的可扩展制备，用于化合物评估和表型筛选。
转化与临床前研究
- 与疾病相关的三维培养模型相一致，有助于转化型生物标志物的发现。
- 支持静态和动态系统的培养，确保从发现到临床前验证的连续性。
- 降低机械损伤风险，支持可靠的临床前模型开发。
流程与工作流整合
这种包封方法通过提供可扩展且可重复的3D人多能干细胞培养和球状体形成平台，连接了早期发现、筛选和临床前研究。
- 发现生物学：在生理学相关的三维系统中支持假设验证和通路阐明。
- 筛选：提供即用型、均一的球形细胞聚集体，并具备定量的活力和形态学指标。
- 分析：实现对包封条件和球形细胞聚集体输出结果的统计学比较。
- 转化研究：有助于与临床前疾病模型和生物标志物策略相衔接。
- 企业级复用：可适配多种细胞类型，并可扩展用于多个研发项目。
运营与企业影响
- 科学价值：提高三维干细胞研究的预测可信度，降低机制上的不确定性。
- 操作价值：实现类球体生产的标准化，具有高重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过生成可靠的早期数据，提升决策通过或终止的质量与资本使用效率。
- 项目组合影响：支持基于风险调整的细胞治疗候选物优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备微流控和三维细胞培养技术方面的专业知识。
- 需要具备同轴流聚焦装置和分析成像基础设施的使用权限。
- 要求跨团队对包封参数和细胞活力检测方法进行标准化。
- 可适用于不同类型的细胞，但可能需要针对每种应用进行优化。
- 微胶囊的机械完整性依赖于精确的流速和配方控制。
