高通量单细胞与多细胞微封装

利用包裹在微小皮升级液滴中的细胞的应用，常常受限于无法控制每个液滴中的细胞数量。本实验方案展示了一种通过结合两种不同的微流控现象——流体动力学细胞有序排列和在流动聚焦式微喷嘴处生成液滴——来精确控制细胞包裹的方法。在上游通道中，提供足够高的流速，使含有悬浮细胞或颗粒的水相溶液流动，从而在下游流动方向上形成间距相等的细胞串列。

采用流动聚焦式液滴生成喷嘴，在表面活性剂稳定的可接受油相载流体中以千赫兹速率形成水相液滴。随后通过调节水相和油相的流速，使液滴生成速率与纵向有序排列的细胞或颗粒到达液滴生成喷嘴的时间同步，从而将有序的细胞或颗粒序列与液滴生成相结合，其中颗粒被用作细胞的替代物。为了演示该方案，流速必须足够小，以限制流体的扰动。

生物细胞上的剪切应力、细胞有序排列的液滴生成重叠现象以及细胞活力。水相流速的限制为单细胞和多细胞的可控包封提供了理想的操作条件。视频显微数据的分析表明，单细胞和双细胞（或颗粒）包封效率均优于随机包封效率，并显著减少不含目标数量细胞或颗粒的液滴数量。

与整体悬浮液相比，对细胞和液滴的限制可减少细胞分泌物的稀释，突出细胞异质性，并调控细胞间信号。将这些细胞高效包封到液滴中的方法为生物研究人员提供了宝贵的工具，以启动本实验流程。首先，在 AutoCAD 软件中设计如本图所示的微通道图案。

长通道段代表宽度为27微米的水相流动聚焦通道。放大的喷嘴示意图显示，水相聚焦通道和油相通道的宽度均为27微米，随后喷嘴收缩至22微米，并突然扩张至更宽的61微米通道。该装置的高度为52微米。

水相和油相入口均设有较大的防堵滤网，滤网间隙与排序通道宽度相当，如油相入口放大示意图所示。此处展示的是注入染料后的排序通道与喷嘴的实际图像。请委托第三方制造商在聚酯薄膜或石英上制作高分辨率透明掩膜，其中通道部分为透明，背景为深色。

随后制备硅胶和SU-8光刻胶的母模，用于复制成型。将母模用胶带固定在培养皿底部，进行PDMS复制成型。复制成型完成后，将器件轮廓切割出来，使用外径为0.75毫米的活检打孔器在本图所示的三个圆形区域打孔以形成流体通道口。将透明胶带贴至PDMS的图案面，然后撕下，以去除等离子体键合后残留的灰尘。

将PDMS粘合到干净的玻璃载玻片上。将整个装置放入烘箱中，并逐渐升温至120摄氏度。在120摄氏度的烘箱中过夜放置该装置，以完成键合，并使PDMS恢复至其原始的疏水状态。

使通道玻璃表面疏水的另一种方法是将涂层（如aqua）注入流体端口，然后用空气吹洗。使用一个1毫升的注射器和注射针，先吸入几百微升空气，再吸取少量aquil，仅需足够填充金属注射器针头即可。小心但牢固地将aqua注入流体端口，随后注入吹洗用空气，注意不要破坏PDMS与玻璃之间的键合。

在擦拭掉任何过量的水以避免干燥后可能堵塞通道的沉积物的同时，对所有进样口和出样口重复进行排气操作。控制细胞浓度对于获得适当数量的细胞与适当数量的液滴至关重要。这包含两个具有挑战性的方面。

第一是预先估算合适的浓度，第二是在实验过程中维持该浓度。对于本研究中使用的特定装置，8至15微米的细胞或颗粒应能充分实现有序排列，以达到可控封装。在本演示中，将使用9.9微米的聚二苯基微球作为细胞替代物，制备水相颗粒悬浮液的浓度，以实现理想的有序封装。起始时采用重量百分比为1%的微球储备液浓度，并参考先前获得的完全有序排列的数据。作为参考，可通过轻柔离心1毫升储备样品，去除250微升上清液，再通过涡旋振荡或更温和的混合方式重悬颗粒，将浓度提高至重量百分比1.5%。

使用细胞时，细胞和聚苯乙烯颗粒的比重均大于1，尽管本视频中未展示这一点。对于持续数分钟至数小时的长期实验，可通过添加溶质（如用于颗粒的氯化钙或用于细胞的OptiPrep）使溶液达到浮力匹配。细胞或颗粒悬浮液准备好后，取10毫升连续相氟化碳油样品，置于15毫升离心管中涡旋混匀。

将表面活性剂与氟碳油混合至约2.5%（重量/重量）。此处我们获得2.4%（重量/重量）的混合液，可用于建立微封装实验。首先，打开倒置光学显微镜和高速相机的电源。

聚焦微通道层，检查通道内是否存在堵塞或可能脱落的碎屑。选择一个无大块碎屑或明显堵塞的通道。截取三段半透明的特氟龙PVC管，分别用于水相入口、油相入口和乳液出口，以最大限度减少死体积。

截取足够长度的管路，使其能从注射泵连接至显微镜。将管路两端以45度角斜切，以便插入流体端口。使用镊子将管路末端压入流体端口。然后将一根30号钝头不锈钢注射针压入水相入口管路的自由端。

对油入口管重复上述操作。移动装置，并使用20倍物镜将管路固定在显微镜载物台上，对准并聚焦于装置喷嘴。手动调节显微镜的科勒照明，以在焦平面上提供最佳照明效果。

使用高速相机软件的裁剪功能，对喷嘴周围的视场进行裁剪，以实现更高的帧率，然后根据最佳录制需求设置帧率、曝光时间及其他相机参数。接下来，用先前配制并充分混匀的水相溶液填充一支1毫升注射器。再用油相溶液填充一支3毫升注射器。

将一支装满液体的注射器垂直竖起，轻弹注射器使气泡移动至注射器出口处。保持注射器垂直，缓慢按压推杆足够长时间，以将空气推至连接针头的注射器尖端。将该注射器连接到设备上已安装好的对应注射器针头。

按下推杆，将空气推过注射器针头的死体积，直至液体被压入管路并接近装置，然后将注射器牢固地安装到注射泵上，并固定推杆块。对第二个注射器重复上述连接步骤，并将其安装至第二个注射泵上。启动两台注射泵，分别进行编程。根据制造商的操作规程，将油相的初始流速设为 50 µL/min，水相设为 5 µL/min。

对于水相起始阶段，泵会等待每种流体进入装置并填充通道，排出残留的死区空气。使用初始流速时，此过程可能需要数分钟。观察喷嘴处液滴的形成情况。

缓慢增加水相流速，以观察长水相溶液通道中颗粒的有序排列。随着流速的增加，切勿将流速提高至喷嘴处触发水相流体射流的程度，如本示例所示；使用不同的液滴生成喷嘴时需注意，此处存在不稳定的流动和不一致的液滴。如果颗粒浓度过低，导致交替颗粒序列中缺失颗粒较多，且样品未进行浮力匹配，则可将注射泵物理性地向注射器出口方向倾斜，以促使颗粒逐渐沉降至注射器出口。

当形成充分的有序排列后，调节油相流速以调整液滴的生成频率和大小。逐步调节两相流速，以达到所需的包封率和液滴体积。一旦确认实现了稳定的有序包封，即将出口管路从废液储液池转移至收集储液池，以备后续使用。

可高效实现单个或双颗粒/细胞的包封。采用本方案所示条件，以每分钟60微升的油相流速和每分钟9微升的水相流速进行操作，可获得典型的单颗粒包封结果。其中，λ（每个液滴的平均颗粒数）为0.95。

完全有序交替排列的颗粒在流动方向上的间距约为17至18微米。本示例中的液滴生成速率为6.1千赫兹，平均液滴体积为24.4皮升。直方图比较了单颗粒包封有序状态下的液滴包封颗粒效率与“加”状态。

在统计学上，对于包含517个液滴的样本，实际观察到含有单个颗粒的液滴平均比例为79.5%，而理论预测的随机封装比例为36.7%。对于包含491个颗粒的样本，最终被正确封装的颗粒所占比例为83.7%，而随机封装的理论比例为37.3%。通过将油相流速降低至30微升/分钟，同时保持水相流速为9微升/分钟，即可实现双颗粒封装。此时，每个液滴平均包含的颗粒数（λ）为1.8，与单颗粒封装情况类似。

完全有序交替排列的颗粒在流动方向上的间距约为17至18微米。与随机包封相比，较大的液滴平均体积为39.8皮升，生成速率为3.8千赫兹。在383个液滴的样本中，含有两个颗粒的有序包封液滴平均比例为71.5%，而预测的随机包封比例为26.8%。在689个颗粒的样本中，最终进入正确包封液滴的颗粒比例为79.5%，而随机包封比例为33.4%。

上述结果共同表明，单颗粒和双颗粒封装效率均比随机封装效率高出两倍以上，且显著减少了不含目标数量细胞或颗粒的液滴数量。本实验过程凸显了合适的细胞或颗粒浓度对实现高封装效率的重要性。尽管油相和水相的流速与此前展示的双颗粒封装实验相同，但每个液滴中细胞的平均数量（lambda）已降低至1.57。

因此，无法实现完全有序排列，导致液滴序列中出现空缺，使得部分液滴所含颗粒数少于预期。该直方图显示，由于Λ值较低，两个颗粒包封效率下降。在324个液滴的样本中，平均含有两个颗粒的液滴比例为55.9%，单颗粒液滴的数量与双颗粒液滴相近。

这表明，为了最大化正确包封的颗粒或细胞数量，Lambda 应等于或接近每滴中所需细胞的数量，具体取决于实验可接受每滴中细胞数量偏少还是偏多。在本演示中，我们利用浮力不匹配来实现实验过程中浓度的实时调控。然而，对于长期实验，建议在将细胞包封入水相液滴后，进行浮力匹配，以获得更一致的结果。

可通过将液滴重新注入微流控阵列，在离心管或显微镜下进行时间依赖性实验。