使用微流控装置进行机械刺激与高分辨率成像 秀丽隐杆线虫

该技术的总体目标是利用带有压力驱动装置的微流控芯片系统，测量线虫及其神经元对外部机械刺激的响应。该方法可解答机械生物学和感觉生物学领域的一些关键问题，例如细胞、组织和动物如何响应机械刺激。该技术的主要优势在于，它能以非侵入性的方式有效限制线虫的活动能力，从而实现高分辨率成像，同时仍可对线虫的角质层施加机械刺激。

该方法还可用于研究机械信号对发育的影响，甚至可应用于其他类似体系，例如离体器官暴露实验或与秀丽隐杆线虫（C. Elegans）体型相似的其他动物。建立显微镜系统，以同时激发 GCaMP 和 RFP。

一种选择是使用仅透射青色和黄色光的隐蔽光源。观察时，使用10倍物镜和高倍物镜。同时，通过数字相机将图像传输至计算机。

接下来，安装一个荧光立方体，如有需要，再添加一个激发滤光片。在立方体内加入一个二向色镜，可反射青色和黄色光，并透射绿色和红色光。设置一个光束分光器，配备截止波长为570纳米的长通二向色镜。

同时，提供一个中心波长为525纳米、带宽为50纳米的绿色光带通发射滤光片，以及一个中心波长为632纳米、带宽为60纳米的红色光带通发射滤光片。将两束光均投射到相机的视场内。确保绿色部分投射到屏幕的上半部分，红色部分投射到下半部分。

务必使用出厂时间少于一个月的微流控芯片。实验装置设置时，首先将过滤后的 M9 培养基加入重力流储液槽中。将储液槽置于芯片上方约 60 厘米处，并将其连接至芯片的一个出口。接着，将另一个出口通过一个具有两个入口的废液容器连接，再将该废液容器的第二个入口连接至蠕动泵。

使用聚乙烯管完成所有连接。接着，组装互连件，即两端带有金属管接头的50毫米管段。将这些互连件压入并连接到六个驱动指中的每一个，以及蠕动泵入口。

现在，将芯片置于光学器件下方。务必保持芯片上的互连结构连接，因为PDMS在反复操作下会迅速磨损。确保PDMS驱动器以及连接芯片与气源的管路密封良好，这对于实现隔膜良好的色度驱动至关重要。

在装载动物之前，检查微流控芯片是否存在压力损失。在目标压力下执行多次驱动循环，测量隔膜的偏转程度。然后将定量测量值与理论预测值进行比较。

如果测量值与预期不符，请检查管路或管路连接处是否存在泄漏。PDMS 的弹性也可能因基础聚合物与固化剂的比例不同而发生变化，或者 PDMS 材料可能因存放过久而过度交联。请按照 Porta-de-la-Riva 及其同事在 2012 年 JoVE 出版物中所述的方法，准备与年轻成虫或成虫第一天年龄同步的 C.elegans。

现在，选取2至5只年轻成虫或孵化一天的雌雄同体线虫。选择正确大小的线虫至关重要：体型过小的线虫无法被通道截留，而体型过大的线虫则难以取出，并可能导致装置堵塞。

用一滴过滤的M9缓冲液将挑选的线虫转移，然后使用1毫升注射器将线虫吸入一段导管中，注意不要将线虫吸入注射器本体内。接着，将导管连接至芯片线虫入口处的连接接口。随后，打开通向储液池的阀门并启动泵，以开启重力驱动流动。

现在，在四倍放大倍数下观察捕获通道，并轻轻推动动物进入装置。将动物加载到等待室后，使用柱塞轻柔地推动其中一只动物至捕获通道前端，使其头部进入通道的锥形区域。如果线虫未能从头部到接近身体末端完全填满通道的整个横截面，则移除该线虫。

许多情况下，体型过小的线虫会直接穿过芯片而不会被捕获。如果需要移除卡在捕获通道中的线虫，只需推动注射器活塞，直到线虫从通道中消失，然后加载新的线虫。一旦线虫被正确加载，切换至荧光模式并增加放大倍数。

为防止信号饱和，务必根据荧光强度调整激发光强度。检查目标神经元的神经突是否跨越某个驱动器的光阑。该驱动器必须位于神经元胞体的前方。

如果不行，可通过拉动或推动柱塞来调整动物的位置。如果仍无法解决，移除线虫并更换新的线虫。此外，如果神经元周围存在自发荧光，也应更换线虫。

当线虫正确装载后，将焦点对准目标神经元的胞体，然后确定芯片上位于其前侧的驱动器，并使用相应的互连装置将该驱动器连接到可编程压力泵。如果实验需要测量驱动器与神经元之间的距离，应调整视野使两者均位于视场内，并使微通道壁与图像上下边缘平行。接下来，使用可编程压力泵设定压力程序。

始终先在零千帕下采集至少50幅图像，以确定基线。然后，设定刺激波形和压力参数。接着，运行成像和压力程序。

记录过程中，目标神经元必须是10像素见方区域中最亮的点。在连续两幅图像中，其移动不得超过10像素，且必须保持在视野范围内。记录期间，当压力和驱动器发生变化时，您可能会观察到荧光强度的变化。

这表明神经元刺激成功。在两次刺激之间，需在零千帕的恒定压力下维持10秒。只要在整段记录过程中，视野中的多个神经元彼此间隔至少10个像素，便可同时记录它们的信号。

为了保存线虫以供后续研究，断开芯片朝向重力流和废液容器的出口。然后轻轻按压推杆，直至整条线虫被推过捕获通道进入流动通道，并继续按压推杆，直到线虫出现在芯片外的液滴中。此时，取下连接的注射器及管路，将芯片外液滴中的线虫吸出并转移至琼脂平板上。

要从通道中移除并处死线虫，请按压柱塞，直至整条线虫被推过捕获通道并进入流动通道。随后，线虫将随液体流出芯片，进入废液容器。在微流控芯片组装完成后，对隔膜的偏转性能进行了测试。

测量值具有可重复性，在450千帕压力下变化极小，不超过一微米。将线虫插入芯片入口后，捕获通道内单个动物的皮肤即暴露于六个致动器之下。在此设计下，PLM神经元通常无法被完全固定，因此可自由地进行横向和纵向移动。

尽管成功激活 PLM 神经元是可行的，但由于尾部运动，记录其钙瞬变信号较为困难。将动物固定后，使用六个致动器中的一个对六种触觉感受神经元（TRN）中的每一种施加机械刺激。共呈现三种不同的持续两秒的刺激。

保持在275千帕的压力、从0升至275千帕的压力斜升，或由75千帕10赫兹正弦波叠加275千帕阶跃组成的振动刺激。各刺激之间以10秒无压力间隔分开。仅当压力达到400千帕以上时，压力斜升和压力阶跃才能激活触觉感受神经元（TRN），而振动刺激则能强烈激活所有TRN。

一旦掌握，该技术可在每条线虫上五分钟内完成。需要注意的是，芯片与盖玻片之间或芯片与连接器之间的密封不良会导致装置泄漏并失败。在完成此操作后，可进一步采用其他方法，如电压成像或向不同神经元靶向递送机械刺激，以表征伤害感受器的机械反应特性。

此外，由于动物在该操作后可以恢复，该技术可用于筛选对机械刺激反应缺陷的突变体。请勿忘记，操作压缩气体和化学品可能具有极高危险性。必要时应采取预防措施，例如穿戴个人防护装备并在通风橱中操作，以避免这些危险。