利用磁珠分析细胞表面黏附在机械张力作用下的重塑过程

本实验的总体目标是利用配体包被的磁性微珠对黏附受体施加外力，从而探究细胞在张力作用下被激活的生化信号通路。该方法有助于解答力学转导领域中的诸多问题，例如由外力表达的张力如何引导细胞分化，或组织顺应性如何驱动细胞发生转化。该技术的主要优势在于，可通过微珠对特定黏附受体亚群施加张力，从而同时刺激大量细胞用于后续的生化分析。

首先，通过涡旋振荡至少30秒，充分重悬原瓶中的超顺磁性甲苯磺酰化微珠。取40微升重悬后的超顺磁性微珠，加入含有1毫升0.1摩尔磷酸钠缓冲液（pH 7.4）的1.5毫升微量离心管中。接着，将该离心管置于磁力分离架上，使磁性微珠与溶液分离。

弃去上清液，并将离心管从磁力分离架上取下。用一毫升 0.1 摩尔磷酸钠缓冲液（pH 7.4）重悬磁珠。洗涤磁珠两次后，将磁珠重悬于一毫升相同缓冲液中。

然后，将100微克的牛纤维连接蛋白或任何其他细胞黏附受体配体加入珠粒中，并涡旋混匀。通过将配体替换为牛血清白蛋白（BSA）、聚-D-赖氨酸或多聚赖氨酸或脱铁转铁蛋白，重复此步骤以设置阴性对照。将珠粒与含有配体的溶液在37摄氏度下于旋转仪中孵育12至24小时。

如果反应结束后出现珠子聚集现象，超声处理不超过10至20秒。接着，使用磁力分离架分离珠子，并吸除剩余溶液。然后加入1毫升含0.2%牛血清白蛋白的PBS溶液。

在37摄氏度下于旋转仪中孵育一小时。使用磁铁，用1毫升添加了0.2%牛血清白蛋白的PBS溶液洗涤磁珠两次。然后在相同缓冲液1毫升中重悬磁珠。

如果磁珠出现聚集，超声处理不超过20至30秒。随后进行细胞实验，或将磁珠在4摄氏度保存最多一个月。在60毫升组织培养皿中，使用适当的生长培养基培养贴壁细胞，直至细胞融合度达到80%。

离心收集配体包被的磁珠后，将沉淀重悬于1毫升含0.2%牛血清白蛋白的PBS溶液中。取100微升配体包被磁珠溶液加入5毫升预热的培养基中，涡旋混匀。随后，吸去60毫米培养皿中的培养基，加入含磁珠的5毫升预热生长培养基。

将悬液在细胞培养条件下孵育20分钟，使磁珠沉降并黏附于细胞表面。此步骤切勿超过20分钟，以免磁珠被吞噬作用内化。随后，使用10X或20X物镜在光学显微镜下观察磁珠。

通过轻轻晃动培养皿检查磁珠的黏附情况，以区分已结合和未结合的磁珠。将一个直径为38毫米的圆形钕磁铁置于普通60毫米培养皿盖的上表面，并使用两个置于盖子下表面的较小的13毫米钕磁铁将其固定。根据所需的实验时间点和细胞培养条件，对施加张力的细胞进行孵育。

将普通培养皿盖换为带磁铁的盖子。由于磁铁磁性很强，操作时需小心谨慎。处理结束后，将培养皿置于冰上，小心吸除培养皿中的全部培养基。

加入 300 微升细胞裂解缓冲液，冰上孵育 10 分钟。然后用细胞刮收集裂解液，并转移至预冷的 1.5 毫升微量离心管中。使用磁力分离架沉淀磁珠，并将总细胞裂解液转移至新的预冷 1.5 毫升微量离心管中。

从珠子分离后获得的总细胞裂解液中取出15微升等分试样，用于蛋白质印迹分析。用1毫升预冷的裂解缓冲液将珠子洗涤三次。然后，向珠子沉淀中加入50微升上样缓冲液。

将悬液涡旋混匀后，使用干式恒温仪在95摄氏度下煮沸5分钟。此组分含有分离得到的黏附复合物。可直接进行生物化学分析，或于-20摄氏度保存该组分。

该图用于展示黏附复合物的纯化效果。GAPDH 免疫印迹用作全细胞裂解液的上样对照，并用于检测黏附复合物的纯度。通过长时间曝光以验证在纯化的黏附复合物组分中不存在胞质信号。

使用纤维连接蛋白包被的微珠来研究在张力作用下，黏附复合物随时间发生的机械转导过程。在通过磁性分离获得黏附复合物组分后，利用蛋白质印迹法分析裂解液和黏附复合物组分。通过免疫印迹检测了作为上样对照的蛋白以及已知在机械张力作用下被招募或发生磷酸化的候选蛋白。

尽管张力并未影响Paxillin向黏附复合物的募集，但其在酪氨酸31位点的磷酸化水平在全细胞裂解液和黏附复合物组分中均因机械张力而增强。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用磁珠对黏附表面蛋白施加张力。一旦掌握该技术，若操作得当，可在两小时内完成实验。

在进行该操作时，重要的是要始终谨慎对待强磁体。完成该操作后，可开展诸如蛋白质印迹、肌动蛋白聚合实验或酶活性检测等生化研究，以回答更多问题，例如激酶活性是否受张力调控。该技术可能有助于细胞生物学领域的研究人员探索细胞中对磁场敏感的信号通路。